स्तनधारी कोशिकाओं से यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का शुद्धिकरण
Summary
प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में पी 53 ट्यूमर सप्रेसर प्रोटीन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करता है। यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को कठोर गैर-विकृत और विकृत स्थितियों के तहत कोशिकाओं से शुद्ध किया गया था।
Abstract
सर्वव्यापी एक प्रकार का पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है जो न केवल स्थिरता को नियंत्रित करता है बल्कि एक सब्सट्रेट प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्य को भी नियंत्रित करता है। यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी प्रक्रिया इंट्रासेल्युलर रूप से होती है और लगभग सभी बुनियादी सेलुलर जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करती है। सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण सब्सट्रेट प्रोटीन के कार्य को नियंत्रित करने में सर्वव्यापी की भूमिका की जांच में सहायता करता है। यहां, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में पी 53 ट्यूमर शमन प्रोटीन के साथ वर्णित किया गया है। यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को कठोर गैर-विकृत और विकृत स्थितियों के तहत शुद्ध किया गया था। कुल सेलुलर फ्लैग-टैग किए गए पी 53 प्रोटीन को गैर-विकृत परिस्थितियों में एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस के साथ शुद्ध किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कुल सेलुलर हिस-टैग किए गए यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को विकृत परिस्थितियों में निकल-चार्ज राल का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। एलुएट्स में यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सफलतापूर्वक पता लगाया गया था। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, किसी दिए गए प्रोटीन के सर्वव्यापी रूपों को स्तनधारी कोशिकाओं से कुशलतापूर्वक शुद्ध किया जा सकता है, जिससे प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में सर्वव्यापी भूमिकाओं पर अध्ययन की सुविधा मिलती है।
Introduction
यूबिकिटिन 76 अमीनो एसिड 1,2,3 का एक क्रमिक रूप से संरक्षित प्रोटीन है। यूबिकिटिन सहसंयोजक रूप से सक्रिय (ई 1), वैवाहिक (ई 2), और लिगेज (ई 3) एंजाइमों से जुड़े कैस्केड के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन पर लाइसिन अवशेषों को बांधता है। यूबिकिटिन को पहले ई 1 एंजाइम द्वारा सक्रिय किया जाता है और फिर इसे ई 2 वैवाहिक एंजाइमों में स्थानांतरित किया जाता है। इसके बाद, ई 3 यूबिकिटिन लिगेस यूबिकिटिन-लोडेड ई 2 एंजाइम और सब्सट्रेट प्रोटीन दोनों के साथ बातचीत करते हैं और यूबिकिटिन के सी-टर्मिनल और सब्सट्रेट 1,2,3,4,5 में लाइसिन अवशेषके बीच एक आइसोपेप्टाइड बंधन के गठन की मध्यस्थता करते हैं। सर्वव्यापी में सब्सट्रेट प्रोटीन पर या स्वयं पर लाइसिन अवशेषों के लिए यूबिकिटिन मोइट्स का लगाव शामिल है, जिससे प्रोटीन मोनोसर्वेशन या पॉलीविकिटिनेशन होता है। यह सर्वव्यापी प्रक्रिया यूकेरियोट्स में इंट्रासेल्युलर रूप से होती है और जैविक प्रक्रियाओं की एक बड़ी विविधता को नियंत्रित करती है। सर्वव्यापी परिणाम के परिणामस्वरूप यूबिकिटिन-प्रोटीसम सिस्टम 1,2,3,4,5 के माध्यम से सब्सट्रेट प्रोटीन का क्षरण होता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स गठन और कोशिकाओं में प्रोटीन तस्करी को नियंत्रित करता है 3,5. सब्सट्रेट प्रोटीन से जुड़े यूबिकिटिन मोइट्स को एंजाइम (डीयूबी) 6,7 को निष्क्रिय करके हटाया जा सकता है। विशेष रूप से, विभिन्न तरीकों से जिसमें यूबिकिटिन श्रृंखलाओं को इकट्ठा किया जाता है, विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए असंख्य साधन प्रदान करते हैं। सब्सट्रेट प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में सर्वव्यापी की सटीक भूमिका अब तक पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रोटीन के प्रभावों के स्पष्टीकरण में योगदान देता है।
पी 53 प्रोटीन सबसे महत्वपूर्ण ट्यूमर शमन प्रोटीन में से एक है और लगभग सभी मानव कैंसर 8,9,10,11 में आनुवंशिक उत्परिवर्तन या निष्क्रियता प्रदर्शित करता है। पी 53 स्थिरता और गतिविधि को विवो में पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा नाजुक रूप से विनियमित किया जाता है, जिसमें सर्वव्यापी, फॉस्फोराइलेशन, एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन12,13 शामिल हैं। पी 53 प्रोटीन का विभिन्न कोशिकाओं में 6 मिनट से 40 मिनट तक का एक छोटा आधा जीवन होता है, जो मुख्य रूप से इसके पॉलीसर्विसंक्रमण और बाद में प्रोटियासोमल गिरावट10,12 के परिणामस्वरूप होता है। माउस डबल मिनट 2 (एमडीएम 2) पी 53 का एक ई 3 यूबिकिटिन लिगेज है जो अपनी ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि12,14,15 को रोकने के लिए पी 53 के एन-टर्मिनस से बांधता है। एमडीएम 2 अपनी स्थिरता को नियंत्रित करने के लिए पी 53 के पॉलीविरूपण और प्रोटीसोमल क्षरण को बढ़ावा देता है और अपने परमाणु निर्यात 12,14,15,16 को सुविधाजनक बनाने के लिए पी 53 के मोनोसर्वीकरण को प्रेरित करता है। यहां, एमडीएम 2-मध्यस्थता पी 53 का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक विधि को विस्तार से पेश करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन की सर्वव्यापी स्थिति को प्रभावित करने वाले नियामकों को विवो सर्वव्यापी परख में इसका उपयोग करके पहचाना जा सकता है जब उन्हें स्तनधारी कोशिकाओं में अतिरंजित या गिरा दिया जाता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी प्रोटीन का उपयोग इन विट्रो डिओविकिशन परख के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जा सकता है। अलग-अलग डीयूबी के साथ सर्वव्यापी सब्सट्रेट्स को इनक्यूबेट करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट डीयूबी की पहचान करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की जा सकती है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन कोशिकाओं में डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रोटीन की भर्ती के लिए एक मचान के रूप में कार्य कर सकते हैं। एक सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को देशी शुद्धिकरण स्थितियों के तहत अनुक्रमिक इम्यूनोप्रेसिपेशन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग व्यापक रूप से सर्वव्यापी द्वारा विनियमित सेलुलर प्रोटीन की जांच के लिए किया जा सकता है।
यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं, जिनमें आत्मीयता-टैग किए गए यूबिकिटिन, यूबिकिटिन एंटीबॉडी, यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन और पृथक यूबिकिटिन-बाइंडिंग डोमेन (यूबीडी) 17 का उपयोग शामिल है। यहां, हम स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए मध्यस्थ के रूप में आत्मीयता-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। पॉली-हिज़-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग अन्य तरीकों पर फायदे प्रदान करता है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को मजबूत विकृतियों की उपस्थिति में शुद्ध किया जाता है, जो सेलुलर प्रोटीन को रैखिक बनाकर और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को बाधित करके निकल-चार्ज राल के लिए गैर-विशिष्ट बंधन को कम करता है। इसके विपरीत, मध्यस्थों के रूप में यूबिकिटिन एंटीबॉडी, यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन और पृथक यूबीडी का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन से बाध्यकारी भागीदारों को प्रभावी ढंग से बाहर नहीं कर सकता है क्योंकि शुद्धिकरण को कम कठोर परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, शुद्धिकरण से इन मध्यस्थों का उपयोग करके असंबंधित प्रोटीन के बंधन में वृद्धि हो सकती है। इसके अलावा, विभिन्न यूबिकिटिन लिंकेज प्रकारों के साथ-साथ यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन या पृथक यूबीडी17 द्वारा मोनो- और पॉली-सर्वव्यापी के लिए एक बाध्यकारी प्रवृत्ति है। पॉली-हिज-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग सभी सेलुलर सर्वव्यापी प्रोटीन को नीचे खींचने में योगदान देता है। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-फ्लैग या एंटी-एचए एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस का उपयोग गैर-विकृत परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर फ्लैग- या एचए-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को इम्यूनोप्रेसिटेट करना आसान बनाता है। एक दूसरा शुद्धिकरण चरण, उदाहरण के लिए, पॉली-हिज-टैग किए गए यूबिकिटिन को लक्षित करने वाले निकल-चार्ज राल द्वारा, डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उच्च शुद्धता के साथ सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक एपिटोप टैगिंग शुद्धिकरण रणनीति को अनुकूलित किया जा सकता है जब एक विशिष्ट एंटीबॉडी को इम्यूनोप्रेसिपिटेट लक्ष्य प्रोटीन को प्रभावी ढंग से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। अंत में, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण, विट्रो में शुद्धिकरण की तुलना में, अधिक शारीरिक परिस्थितियों में लक्ष्य प्रोटीन के यूबिकिटिन लिंकेज मोड को बरकरार रखता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लगभग सभी शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेलुलर प्रक्रियाओं में सर्वव्यापी महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। हाल के वर्षों में, सिग्नलिंग मार्गों में यूबिकिटिन की आणविक भूमिका को समझने में बड़ी प्रगति ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81972624) से डीएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
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