Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller
Summary
Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att rena ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller med hjälp av p53-tumörsuppressorproteinet som exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades från celler under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden.
Abstract
Ubiquitination är en typ av posttranslationell modifiering som reglerar inte bara stabiliteten utan också lokaliseringen och funktionen hos ett substratprotein. Ubiquitinationsprocessen sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar nästan alla grundläggande cellulära biologiska processer. Rening av ubiquitinerade proteiner hjälper till att undersöka ubiquitinationens roll för att kontrollera funktionen hos substratproteiner. Här beskrivs ett steg-för-steg-förfarande för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller med p53-tumörsuppressorproteinet som ett exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden. Totalt cellulärt flaggmärkt p53-protein renades med anti-flaggantikroppskonjugerad agaros under icke-denaturerande förhållanden. Alternativt renades totalt cellulärt His-märkt ubiquitinerat protein med användning av nickelladdat harts under denatureringsförhållanden. Ubiquitinerade p53-proteiner i eluaterna detekterades framgångsrikt med specifika antikroppar. Med hjälp av denna procedur kan de allestädes närvarande formerna av ett givet protein effektivt renas från däggdjursceller, vilket underlättar studier av ubiquitinationens roller vid reglering av proteinfunktionen.
Introduction
Ubiquitin är ett evolutionärt konserverat protein av 76 aminosyror 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner genom kaskader som involverar aktiverande (E1), konjugerande (E2) och ligas (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveras först av E1-enzymet och överförs sedan till de E2-konjugerande enzymerna. Därefter interagerar E3 ubiquitinligaser med både ubiquitinbelastade E2-enzymer och substratproteiner och förmedlar bildandet av en isopeptidbindning mellan C-terminalen av ubiquitin och en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverar bindning av ubiquitindelar till lysinrester på substratproteiner eller till sig själv, vilket leder till proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denna ubiquitinationsprocess sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar en mängd olika biologiska processer. Ubiquitination resulterar i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Dessutom modulerar ubiquitination protein subcellulär lokalisering, proteinkomplexbildning och proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindelar som ligerats till substratproteiner kan avlägsnas med deubiquitinerande enzymer (DUB)6,7. I synnerhet ger de olika sätten på vilka ubiquitinkedjor monteras en myriad av medel för att reglera olika biologiska processer 1,5. De exakta rollerna för ubiquitination för att reglera substratproteinfunktionen förblir ofullständigt förstådda hittills. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att belysa effekterna av proteinubiquitination på en mängd olika cellulära processer.
P53-proteinet är ett av de viktigaste tumörsuppressorproteinerna och uppvisar genetiska mutationer eller inaktivering i nästan alla mänskliga cancerformer 8,9,10,11. p53 stabilitet och aktivitet regleras delikat in vivo genom posttranslationella modifieringar, inklusive ubiquitination, fosforylering, acetylering och metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid som sträcker sig från 6 min till 40 min i olika celler, vilket huvudsakligen beror på dess polyubiquitination och efterföljande proteasomala nedbrytning10,12. Mus dubbelminut 2 (Mdm2) är en E3 ubiquitinligas av p53 som binder till N-änden av p53 för att hämma dess transkriptionella aktivitet12,14,15. Mdm2 främjar polyubiquitination och proteasomal nedbrytning av p53 för att kontrollera dess stabilitet och inducerar monoubiquitination av p53 för att underlätta dess kärnexport12,14,15,16. Här används Mdm2-medierad p53-ubiquitination som ett exempel för att introducera en metod för rening av ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller i detalj. De regulatorer som påverkar målproteinernas ubiquitinationsstatus kan identifieras med hjälp av denna in vivo ubiquitinationsanalys när de överuttrycks eller slås ner/slås ut i däggdjursceller. Dessutom kan ubiquitinerade proteiner användas som substrat för in vitro-deubiquitinationsanalys. En screening med hög genomströmning kan utföras för att identifiera specifika DUB för målproteiner genom att inkubera ubiquitinerade substrat med enskilda DUB. Ubiquitinerade proteiner kan fungera som en byggnadsställning för att rekrytera nedströms signaleringsproteiner i celler. Ett ubiquitinerat målproteinkomplex kan renas genom sekventiell immunoprecipitation under inhemska reningsförhållanden och identifieras med masspektrometri. Det nuvarande protokollet kan användas i stor utsträckning för att undersöka de cellulära proteiner som regleras av ubiquitination.
Flera metoder har etablerats för att rena ubiquitinerade proteiner, som inkluderar användning av affinitetsmärkt ubiquitin, ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade ubiquitinbindande domäner (UBD)17. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder affinitetsmärkt ubiquitin som medlare för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin erbjuder fördelar jämfört med de andra metoderna. Ubiquitinerade proteiner renas i närvaro av starka denatureringsmedel, vilket minskar icke-specifik bindning till nickelladdat harts genom att linjärisera cellulära proteiner och störa protein-proteininteraktioner. Däremot kan användningen av ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade UBD som mediatorer effektivt utesluta bindande partners från målprotein eftersom rening måste utföras under mindre stränga förhållanden. Dessutom kan rening också leda till ökad bindning av orelaterade proteiner med hjälp av dessa mediatorer. Dessutom finns det en bindningsbenägenhet för olika ubiquitinlänktyper samt mono- och poly-ubiquitination av ubiquitinbindande proteiner eller isolerade UBD17. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin bidrar till att dra ner alla cellulära ubiquitinerade proteiner. Alternativt gör användningen av kommersiellt tillgänglig anti-flagga eller anti-HA-antikroppskonjugerad agaros det lättare att immunoprecipitera storskaliga flagg- eller HA-märkta målproteiner under icke-denaturerande förhållanden. Ett andra reningssteg, till exempel av nickelladdat harts riktat mot poly-His-märkt ubiquitin, kan användas för att förvärva allestädes närvarande målproteiner med hög renhet för nedströmsexperiment. I synnerhet kan en epitopmärkningsreningsstrategi anpassas när en specifik antikropp inte kan förvärvas för att immunoprecipitera målproteiner effektivt. Slutligen behåller rening av ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller, i jämförelse med rening in vitro, ubiquitinbindningsläget för målproteiner under mer fysiologiska förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitination spelar en kritisk roll i nästan alla fysiologiska och patologiska cellulära processer2. Under de senaste åren har stora framsteg gjorts för att förstå ubiquitins molekylära roll i signalvägar och hur förändringar i ubiquitinsystemet leder till olika mänskliga sjukdomar2. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att ge insikt i de exakta rollerna för ubiquitination i dessa processer. Blandningarna av ubiquitinkonjugerade proteiner kan renas f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (81972624) till D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
