Den præsenterede metode tilbyder en innovativ måde at konstruere biomimetiske fiberstrukturer i tredimensionelle (3D) stilladser (f.eks. Hjerteklapfoldere). 3D-printede, ledende geometrier blev brugt til at bestemme form og dimensioner. Fiberorientering og egenskaber var individuelt justerbare for hvert lag. Flere prøver kunne fremstilles i en opsætning.
Elektrospinding er blevet en meget anvendt teknik inden for kardiovaskulær vævsteknik, da det giver mulighed for at skabe (mikro-)fibrøse stilladser med justerbare egenskaber. Formålet med denne undersøgelse var at skabe flerlags stilladser, der efterligner de arkitektoniske fiberegenskaber ved menneskelige hjerteklapfoldere ved hjælp af ledende 3D-trykte samlere.
Modeller af aortaklappen cusps blev oprettet ved hjælp af kommerciel computerstøttet design (CAD) software. Ledende polymælkesyre blev brugt til at fremstille 3D-trykte indlægsseddelskabeloner. Disse cusp negativer blev integreret i en specielt designet, roterende elektrospinning dorn. Tre lag polyurethan blev spundet på samleren og efterlignede fiberorienteringen af menneskelige hjerteklapper. Overflade- og fiberstruktur blev vurderet med et scanningselektronmikroskop (SEM). Anvendelsen af fluorescerende farvestof tillod desuden mikroskopisk visualisering af den flerlagede fiberstruktur. Trækprøvning blev udført for at vurdere stilladsernes biomekaniske egenskaber.
3D-print af væsentlige dele til elektrospinning riggen var mulig på kort tid for et lavt budget. Aortaklappens cusps oprettet efter denne protokol var trelags med en fiberdiameter på 4,1 ± 1,6 μm. SEM-billeddannelse afslørede en jævn fordeling af fibre. Fluorescensmikroskopi afslørede individuelle lag med forskelligt justerede fibre, hvor hvert lag præcist nåede den ønskede fiberkonfiguration. De producerede stilladser viste høj trækstyrke, især langs justeringsretningen. Udskrivningsfilerne til de forskellige samlere er tilgængelige som Supplerende fil 1, Supplerende fil 2, Supplerende fil 3, Supplerende fil 4 og Supplerende fil 5.
Med en højt specialiseret opsætnings- og workflowprotokol er det muligt at efterligne væv med komplekse fiberstrukturer over flere lag. Spinding direkte på 3D-trykte samlere skaber betydelig fleksibilitet i fremstillingen af 3D-former til lave produktionsomkostninger.
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag i vestlige lande 1. Selv om der forskes grundigt i dette område, vurderes det, at byrden ved degenerativ hjerteklapsygdom vil stige yderligere i løbet af de næste år2. Kirurgisk eller interventionel udskiftning af hjerteklappen er mulig som en terapeutisk mulighed. På dette tidspunkt er mekaniske og bioprotetiske hjerteklapper tilgængelige, begge med individuelle ulemper. Mekaniske ventiler er trombogene og kræver livslang antikoagulation. Selvom biologiske ventiler ikke kræver antikoagulation, viser de mangel på ombygning, en høj forkalkningshastighed og samtidig nedbrydning3.
Vævskonstruerede hjerteklapper kan muligvis løse disse ulemper ved at indføre et mikrofibrøs stillads i kroppen, der tillader in vivo-ombygning. Forskellige metoder, f.eks. elektrospinding (ESP), decellularisering, mikroformning, spray, dip-coat og 3D-bioprint, er tilgængelige. Disse metoder kan vælges til at skabe specifikke egenskaber, være billigere og hurtigere eller bare på grund af mangel på alternativer. Metoder og materialer kan endda kombineres for at skabe mere komplekse strukturer4. For eksempel har ESP været en standardteknik til at skabe stilladser inden for vævsteknik, hvilket muliggør kombination af forskellige materialer og justering af fiberdiametre, fiberorienteringer og porøsiteter4. Desuden giver en række efterbehandlingsteknikker mulighed for optimeret vævsombygning, forbedret hæmokompatibilitet og justerbar bionedbrydning af elektrospundet stilladser 5,6,7.
Basic ESP bruger enten statiske eller roterende samlere, som har en direkte indflydelse på graden af fiberjustering og de opnåede fiberdiametre8. På grund af produktionsbegrænsninger består klassiske ESP roterende samlere af roterende tromler, skiver, ledninger eller metalstænger. Indførelsen af 3D-udskrivning giver mulighed for at skabe mere individualiserede samlergeometrier, der ikke er begrænset af traditionelle fremstillingsteknikker. Denne individualisering er især nyttig til oprettelse af 3D-konstruktioner såsom hjerteklapfoldere.
Den naturlige trelags (fibrosa, spongiosa, ventricularis) arkitektur af humane hjerteklapfoldere er vævets reaktion på de mekaniske kræfter og forskydningsstress, de udsættes for under hjertecyklussen 9,10. Fibrene i lamina fibrosa er orienteret omkreds, mens fibrene i lamina spongiosa er tilfældigt justeret og lamina ventricularis radialt. Et tredobbelt lag med de tilsvarende fiberretninger foreslås således at efterligne egenskaberne af disse ventiler i et vævskonstrueret stillads.
Workflowprotokollen beskriver en innovativ metode til at producere trelags 3D-hjerteklapfoldere ved hjælp af 3D-print og elektrospinding. Derudover præsenteres et kvalitetskontroltrin for at sikre nøjagtig fiberorientering i hvert lag.
Den beskrevne protokol præsenterer to innovationer inden for (kardiovaskulær) vævsteknik: billig fremstilling af helt 3D-trykte fantomer til elektrospinding og brugen af en alsidig samler til at producere tilpasningsdygtige, flerlags hjerteklapfoldere.
For nylig er 3D-print blevet et værdifuldt værktøj til produktion af laboratorieudstyr, f.eks. bioreaktorer eller produktions- og testopsætninger11,12. Derfor var det muligt at fremstille elektrospinningsopsætningen, der blev præsenteret i denne undersøgelse, på kort tid og til et overkommeligt budget (tabel 1). Dette er i tråd med tidligere resultater for billig produktion af elektrospinningsopsætninger ved hjælp af 3D-print13.
Desuden er det efter forfatternes bedste overbevisning første gang, at et ledende 3D-printmateriale blev brugt til at skabe en elektrospinningsopsamler til hjerteklapfoldere. Indtil videre er 3D-printede samlere enten fremstillet ved metallasersintring14 eller ved hjælp af ikke-ledende polymerprint og efterfølgende efterbehandling med en ledende belægning15. I modsætning til denne nye tilgang er disse procedurer i en betydelig ulempe, da de er dyrere, tager meget længere tid eller kræver mere manuelt arbejde.
Elektrospinding afhænger af en lang række variabler, der påvirker morfologien af de skabte fibre. Selvom forskellige kommercielle elektrospinningsopsætninger er tilgængelige på markedet, bruger mange forskningsgrupper meget individualiserede opsætninger til at matche deres specifikke behov16. Under hensyntagen til dette skal de beskrevne værdier i denne protokol (spænding, afstand og rotationshastighed) muligvis tilpasses til individuelle opsætninger og bør ses som et udgangspunkt snarere end faste værdier. Desuden er det kendt, at miljøparametre kan have en betydelig indflydelse på elektrospindingsresultaterne17,18. Derfor anbefales det stærkt at kontrollere mindst temperatur og fugtighed i elektrospindingsriggen. Optimale elektrospinningsresultater blev opnået mellem 15-20% relativ luftfugtighed ved en temperatur mellem 21 og 24 °C. For at følge denne protokol er følgende udstyr afgørende: en motor, der er i stand til at accelerere en kollektor, der vejer ca. 300 g til en omdrejningshastighed på 2.000 o / min, en sprøjtepumpe, der er velegnet til små volumenstrømningshastigheder på 1-3 ml / t, og en topolet strømforsyningsenhed, der er i stand til ±20 kV jævnstrøm (DC).
I tråd med tidligere undersøgelser var det muligt at visualisere den fibrøse struktur af de elektrospundede stilladser ved fluorescensmikroskopi19. Det var muligt med succes at demonstrere stilladsets flerlagsstruktur, herunder de forskellige fiberorienteringer. Især når man arbejder med flere lag eller flere materialer, bør indførelsen af fluorescerende farvestoffer betragtes som en standardprocedure for streng kvalitetskontrol. Det kan forbedre den visuelle vurdering af resultater efter ændringer i parametrene eller arbejdsgangsprotokollen. Det kan ikke anbefales at anvende farvestof i stilladser, der skal anvendes til in vivo – eller in vitro-vurdering . Dette er vigtigt for at undgå interferens med etablerede analysemetoder.
Efterligning af naturlig hjerteklapmorfologi er af stor betydning for at producere en vævskonstrueret replikat, der skal bruges som en hjerteklapprotese (figur 4B). Det har vist sig, at den specifikke ventilgeometri har stor indflydelse på in vivo-ombygning 20. I denne sammenhæng er 3D-print af brochuregeometrien til elektrospinding en fordel, da iterationer er nemme og hurtige at implementere. Selv produktion af personlige ventilgeometrier er tænkelig, og efterfølgende udvikling af individuelle og personaliserede 3D-modeller af hjerteklapabnormiteter, for eksempel til undervisningsformål, er mulig.
Yderligere forbedring af vævskonstruerede hjerteklapegenskaber er i centrum for den nuværende forskningsindsats, da flere forskergrupper har arbejdet på at udvikle flerlags stilladser med definerede fiberorienteringer. Masoumi et al. fremstillede kompositstilladser fra et støbt polyglycerolbakatlag og elektrospundet polycaprolacton (PCL) fibermåtter21. Således kunne et tredobbelt lag skabes ud af to orienterede elektrospundet lag adskilt af et ark mikrofabrikeret polyglycerolbacate. Men i modsætning til stilladserne ved hånden var de hverken i en 3D-form eller efterlignede tilstrækkeligt mellemlaget (spongiosa). En anden tilgang til fremstilling af en bioinspireret vævskonstrueret hjerteklap blev forfulgt af Jana et al.22,23. De producerede med succes tredobbelte stilladser med orienterede fibre ved hjælp af aluminiumssamlere til PCL-baseret elektrospinding. Igen præsenterede disse stilladser også morfologiske ufuldkommenheder, da de kun har et 2D-udseende, og det endelige stillads er gennemtrængt af eger.
Selvom protokollen giver detaljerede oplysninger om, hvordan 3D, tredobbelte hjerteklapfoldere produceres, er der flere flere trin, der er nødvendige for at skabe en egentlig hjerteklapprotese. En stent med en diameter på 24 mm anbefales til de her beskrevne foldere. Som supplement til den anvendte stent kan brochurerne forsynes med yderligere støttestrukturer til syning. For at give maksimal fleksibilitet er de brochurer, der er vist her, ikke individualiseret til et specifikt stentdesign. Dette kan gøres ved blot at ændre skabelonen ved hjælp af CAD-software.
Selvom den anvendes til hjerteklapvævsteknik, vil den præsenterede metode være let anvendelig til elektrospinningopsætninger i ortopædi24, urologi25, otolaryngologi26 og andre. Produktionen af sofistikerede og /eller individualiserede 3D-konstruktioner er mulig ved implementering af andre 3D-trykte samlere. Selvom samlerens materiale har ændret sig, forbliver princippet om elektrospinding intakt27. Derfor er brugen af forskellige polymerer teoretisk mulig, selvom justering af elektrospindingsparametrene kan være nødvendig.
Samlet set beskriver den præsenterede protokol en nem og omkostningseffektiv måde at fremstille flerlags hjerteklapfoldere på. Anvendelsen af 3D-udskrivning giver mulighed for hurtig tilpasning og ændringer af samleren og indsatserne. Dette muliggør produktion af patientspecifikke proteser uden en kompliceret fremstillingsproces af for eksempel metalsamlere. Flere prøver kan oprettes i en kørsel under identiske betingelser. Derfor kan materialedestruktive tests udføres på prøverne med den fordel, at der er (næsten) identiske dem tilbage til at opbygge den faktiske ventil. Inkluderingen af udskrivningsfilerne som supplerende filer i denne undersøgelse er beregnet til at understøtte udviklingen af flerlags hjerteklapstilladser. Denne nye elektrospindingsteknik har også et stort potentiale for andre områder af regenerativ medicin, da modificerede samlere og andre 3D-printede, roterende skabeloner er nemme at implementere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), projektnummer MA 2186/14-1.
BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
PLA | Ultimaker BV | PLA | |
Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma – Aldrich | S 7635 | Texas Red |
Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |