Isolamento, Expansão e Diferenciação de Células-Tronco Mesenquimais do Coxim de Gordura Infrapatelar da Articulação Sufocante de Cabra

Resumo

As células-tronco mesenquimais da almofada de gordura infrapatelar (IFP-MSCs) podem ser facilmente isoladas da almofada de gordura infrapatelar da articulação do joelho. Eles proliferam bem in vitro, formam colônias de UFC-F e se diferenciam em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas. Aqui, a metodologia para o isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabra é fornecida.

Resumo

O IFP, presente na articulação do joelho, serve como uma fonte promissora de CTMs. O IFP é um tecido de fácil acesso, pois é rotineiramente ressecado e descartado durante procedimentos artroscópicos e cirurgias de substituição do joelho. Além disso, sua remoção está associada a morbidade mínima do local doador. Estudos recentes demonstraram que as IFP-MSCs não perdem sua capacidade de proliferação durante a expansão in vitro e têm potencial de diferenciação osteogênica independente da idade. As IFP-MSCs possuem potencial de diferenciação condrogênica superior em comparação com as MSCs derivadas da medula óssea (BMSCs) e as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs). Embora essas células sejam facilmente obtidas de pacientes idosos e doentes, sua eficácia é limitada. Assim, o uso de IFP-MSCs de doadores saudáveis é importante para determinar sua eficácia em aplicações biomédicas. Como o acesso a um doador humano saudável é um desafio, os modelos animais podem ser uma alternativa melhor para permitir a compreensão fundamental. Animais de grande porte, como cães, cavalos, ovelhas e cabras, desempenham um papel crucial na pesquisa translacional. Entre estes, a cabra pode ser um modelo preferido, uma vez que a articulação sufocante da cabra tem a anatomia mais próxima da articulação do joelho humano. Além disso, o IFP de cabra pode atender aos números mais altos de MSC necessários para aplicações de regeneração de tecidos. Além disso, o baixo custo, a disponibilidade e a conformidade com os princípios 3R para pesquisa com animais os tornam um modelo atraente. Este estudo demonstra um protocolo simples para o isolamento de IFP-MSCs da articulação sufocante de caprinos e condições de cultura in vitro para sua expansão e diferenciação. O IFP assepticamente isolado da cabra foi lavado, picado e digerido enzimaticamente. Após filtração e centrifugação, as células coletadas foram cultivadas. Essas células eram aderentes, tinham morfologia semelhante a MSCs e demonstraram notável capacidade clonogênica. Além disso, eles se diferenciaram em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, demonstrando sua multipotência. Em conclusão, o estudo demonstra o isolamento e a expansão das CTMs, que mostram potencial em aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são um candidato atraente para terapias baseadas em células em medicina regenerativa ^1,2. Eles podem ser colhidos de uma variedade de fontes de tecido, como medula óssea, cordão umbilical, placenta, polpa dentária e tecido adiposo subcutâneo³. No entanto, como a disponibilidade de células-tronco em adultos é limitada e seu procedimento de isolamento é frequentemente invasivo (resultando em morbidade no local doador), é desejável ter uma fonte alternativa de células-tronco que possa contornar esses desafios.

A articulação ....

Protocolo

O protocolo baseia-se no isolamento de IFP-MSCs de cabras. IFP de cabra e sangue foram coletados de um matadouro local. Uma vez que tais coleções de tecidos estão fora da alçada de um Comitê Institucional de Ética Animal, a aprovação ética não era necessária.

1. Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial do joelho caprino

1. Coletar articulação femorotibial caprina (amostra) abrangendo ~15 cm cada uma das regiões femoral e tibial dos membros posteriores. Colocar imediatamente a amostra numa caixa de recolha de amostras esterilizada e armazená-la a 4 °C para transporte para o laboratório para posterior transfo....

Resultados

Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial de caprinos
As etapas envolvidas no isolamento das IFP-MSCs da articulação sufocante de uma cabra estão representadas na Figura 1. A almofada de gordura presente na superfície interna não articulada da patela foi removida, picada e digerida enzimaticamente. As IFP-MSCs foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso (Figura 2A).

Expansão e capacid.......

Discussão

No presente protocolo, um método simples, confiável e reprodutível para o isolamento de CTMs do IFP caprino foi fornecido. Células isoladas usando este método foram usadas com sucesso em nossos estudos anteriores para regeneração tecidual in vitro. Observou-se que as células isoladas eram proliferativas, respondiam a diversos fatores de crescimento e mantinham sua atividade biológica quando semeadas em fibras eletrofiadas e andaimes^25,26. Além disso, obs.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0,25% Tripsina- 0,02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15 mL tubo de centrífuga	Corning
2-Fosfo-L-ácido ascórbico sal trissódico	Sigma	49752-10G	50 µ g/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4- (2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico ácido (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL tubo de centrífuga	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	Para coloração de gicosaminoglicanos sufatados
Alizarin Red S	S S D Fine-Chem Limited	26048-25G	Para deposição de cálcio
Anfotericina B	HiMedia	A011	2.5 µ g/mL
Fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrato	Sigma	B5655-5TAB	Para coloração ALP
Gabinete
BSA	HiMedia	MB-083	Nome longo: Albumina de soro bovino (1,25 mg/mL)
Filtro de células	HiMedia	TCP-182	70 µ m
Centrífuga	REMI
Ciprofloxacina	RANBAXY LAB. Limitado	B17407T1	2.5 µ g/mL
Cristal Violeta	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glicose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915	1 µ M
DMEM LG	SIGMA	D5523	Nome longo: Dulbecco' s Águia Modificada' s Mídia Baixo
Álcool Etílico	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Nome longo: Solução de formaldeído de soro bovino fetal
37%-41%	Merck	61780805001730
Indometacina	Sigma-Aldrich	I7378	100 µ
M Insulina	Sigma-Aldrich	I9278 10	µ g/mL
inverteu o	TS 100
do microscópio + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Nome longo: insulina, transferrina, selenito do sódio + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
cloreto de magnésio	Merck	61751605001730	para o tampão Meck
		1,07018,2521	do magnésio do tampão da lise
Micropipetas e pontas estéreis (20 µ L, 200 µ L, 1000 µ L)	Thermoscientific
MUSE Analisador celular	Merck Millipore		Para contagem de células
OCT composto	Tissue-Tek	4583	Nome longo: Temperatura de corte ideal
Óleo Red O corante	S D Fine-Chem Limited	54304	Para coloração de vacúolo lipídico
Penicilina-Estreptomicina	HiMedia	A007	100 U / mL
Petri pratos (150 mm e 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	Para coloração de gicosaminoglicanos sufatados
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	C3434	3,4 % (p/v)
Tesouras, pinças			Para isolamento de IFP-MSC
Sacarose	Merck	1.94953.0521	35 % (p/v)
TGF- β 1	Sino Biologicals		Nome longo: Fator de crescimento transformador- β 1 (10 ng/mL)
Incubadora de cultura de tecidos 37 ° C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	Para tampão de lise
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	Para tampão de lise
Colagenase tipo II	Gibco	17101015	1,5 mg/mL
Vitamina D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Placas de poço (6 -WP e 24-WP)	ninho

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