Summary
Her hadde vi som mål å oppnå en formulering ved dopaminbelastning av de isolerte eksosomene av stamceller fra Whartons gelémesenkymale stamceller. Eksosomisolering og karakterisering, legemiddelbelastning i de resulterende eksosomene og den cytotoksiske aktiviteten til den utviklede formuleringen er beskrevet i denne protokollen.
Abstract
Eksosomer mellom 40 og 200 nm i størrelse utgjør den minste undergruppen av ekstracellulære vesikler. Disse bioaktive vesiklene utskilt av celler spiller en aktiv rolle i intercellulær last og kommunikasjon. Exosomer finnes for det meste i kroppsvæsker som plasma, cerebrospinalvæske, urin, spytt, fostervann, råmelk, morsmelk, leddvæske, sæd og pleurasyre. Tatt i betraktning størrelsen på eksosomer, antas det at de kan spille en viktig rolle i sykdommer i sentralnervesystemet fordi de kan passere gjennom blod-hjernebarrieren (BBB). Derfor har denne studien som mål å utvikle et eksosombasert nanobærersystem ved å innkapsle dopamin i eksosomer isolert fra Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs). Exosomer som passerte karakteriseringsprosessen ble inkubert med dopamin. De dopaminbelastede eksosomene ble rekarakterisert ved slutten av inkubasjonen. Dopaminbelastede eksosomer ble undersøkt i medikamentfrigivelses- og cytotoksisitetstester. Resultatene viste at dopamin kunne bli vellykket innkapslet i eksosomene, og at de dopaminbelastede eksosomene ikke påvirket fibroblastens levedyktighet.
Introduction
Exosomer, bioaktive vesikler med betydelige egenskaper, varierer i størrelse fra 40 nm til 200 nm. Exosomer stammer fra cellemembranen og dannes på grunn av frigjøring av endosomene1. Disse strukturene tjener som celle-til-celle-kommunikatorer og interagerer med naboceller for å lette overføringen av aktive molekyler. Exosomer kan isoleres fra mange forskjellige kilder. Disse inkluderer kroppsvæsker som plasma, urin, cerebrospinalvæske, spytt, samt cellelinjer dyrket under in vitro-forhold . Eksosomer har en viktig rolle i eliminering av nerveskader, takket være biomakromolekylene de inneholder, som lipider, proteiner og nukleinsyrer2. Glia, som er støttecellene i nervesystemet3, overfører proteiner og mikro-RNA til aksonene til nevroner via eksosomer4.
Lipider som danner myelinskjeden, som er et karakteristisk trekk ved nerveledning, frigjøres også fra oligodendrocytter via eksosomer 4,5. Exosomer er også involvert i prosesser som synaptisk plastisitet, neuronal stressrespons, celle-cellekommunikasjon og neurogenese i hjernen 6,7. Det faktum at eksosomer har nano-dimensjoner gjør at de kan passere gjennom BBB. Det er en spesiell overgangsrute fra interstitialvæsken til cerebrospinalvæsken etter penetrering av denne membranen8. Takket være overflateegenskapene kan eksosomer samhandle effektivt med målceller som et legemiddelleveringssystem og aktivt levere de lastede legemidlene.
På grunn av ekspresjonen av forskjellige klebende proteiner (tetraspaniner og integriner) på overflaten av eksosomer, kan disse ekstracellulære vesiklene lett samhandle og smelte sammen med vertscellemembraner9. Det antas at eksosomer kan brukes som et legemiddelleveringssystem, spesielt ved behandling av sykdommer i sentralnervesystemet på grunn av deres evne til å trenge inn i BBB og deres overflateegenskaper. Mesenkymale stamcelle (MSC)-avledede eksosomer har lavere risiko for immunavstøtning sammenlignet med allogene cellulære terapier, og i denne forbindelse kan de være en viktig komponent i cellefrie behandlingsapplikasjoner10.
Dopamin er et molekyl hvis mangel i hjernen er det karakteristiske trekk ved Parkinsons sykdom (PD), forverres dagfor dag 11,12,13. Det er kjent at PD er assosiert med degenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra av mesencephalon og tap av motorneuronfunksjoner14,15. Døden av dopaminerge nevroner forhindrer tilførsel av nevrotransmitteren dopamin til hjernens striatum. Dette resulterer igjen i fremveksten av PD-spesifikke symptomer16. Disse symptomene på PD er bradykinesi, postural ustabilitet, stivhet og spesielt hviletremor12,13. Selv om PD først ble beskrevet for mer enn to århundrer siden, pågår studier for å forstå sykdommens patologi og etiologi fortsatt, og det er for tiden akseptert at PD er en kompleks systemisk sykdom17. Det er spådd at dopaminmangel oppstår, og kliniske PD-symptomer observeres når mer enn 80% av nevronene degenererer18. Ved behandling av sykdommen foretrekkes ufullstendig dopamintilskudd for å redusere motoriske symptomer. In vivo studier har vist at direkte infusjon av dopamin i hjernen signifikant reduserer symptomer hos dyr19. Dopaminforløpere som L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenylalanin) og dopaminreseptormedikamenter brukes i klinikken fordi direkte infusjon av dopamin i hjernen ikke er mulig hos mennesker og dopamin som kommer inn i systemet ikke kan krysse BBB20. Disse typer stoffer mister sin effektivitet over tid. Imidlertid er det fortsatt ingen kurativ behandlingstilnærming for PD. Derfor er det et stort behov for å utvikle nye terapeutiske strategier og behandlingsmodaliteter for å avsløre patofysiologien til sykdommen og redusere virkningen av PD på pasienter.
Eksosombaserte studier har nylig fått oppmerksomhet for å samle informasjon om både terapeutiske tilnærminger og patologier av sykdommer i nervesystemet. MSC-avledede eksosomer har vist seg å redusere betennelse i nerveskader og bidra til nevronregenerering21,22,23. I tillegg har det blitt rapportert at MSC-avledede eksosomsekretamer reduserer apoptose ved å vise nevrotrofiske og nevrobeskyttende effekter, spesielt på dopaminerge nevroner24,25. Forskning på plattformer der eksosomer brukes som terapeutiske legemiddelleveringssystemer har intensivt akselerert de siste årene. I mange studier har det blitt observert at relevante legemidler lett kan innkapsles i eksosomer og leveres trygt inn i målceller, vev og organer26,27. Ulike metoder som inkubasjon, fryse / tine sykluser, sonikering og ekstrudering kan brukes til legemiddelbelastning i eksosomer28.
Coincubation med eksosomer eller eksosomlignende vesikler gjør at lipofile små molekyler kan passivt innkapsles i disse leveringssystemene28,29,30. Spesielt ble forskjellige molekyler som curcumin 31, katalase 30, doksorubicin32 og paklitaksel33 effektivt lastet inn i eksosomer. Det har blitt observert at katalaseholdige eksosomer, som har antioksidantaktivitet, effektivt akkumuleres i nevronene og mikroglialcellene i hjernen og viste sterke nevrobeskyttende aktiviteter30. I den samme studien, saponin, lagt inn i komplekset for å øke belastningseffektiviteten, ble funnet å øke stoffbelastningsprosenten under inkubasjon30,34. Imidlertid er det behov for ytterligere studier for å etablere standarder for legemiddelbelastning i eksosomer.
Denne artikkelen beskriver utviklingen av et nanobærersystem ved innkapsling av dopamin i eksosomer som ble isolert fra WJ-MSC. Alle trinn, inkludert dyrking av WJ-MSC, isolering og karakterisering av eksosomer, legemiddelbelastningseksperimenter, karakterisering av dopaminbelastede eksosomer med forskjellige teknikker og in vitro cytotoksisitetsanalyse er forklart i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Dyrking og kryopreservering av Whartons gelé mesenkymale stamceller
- Fjern WJ-MSC (fra ATCC) fra fryseren ved -80 °C. Frø cellene til en kolbe som inneholder DMEM-F12 medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Inkuber dem ved 37 ° C i en inkubator som inneholder 5% CO2.
- Endre kulturmediet hver 2. Pass cellene når de når 80% sammenløp. Vask cellene som skal passeres med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
NOTAT: Vask med PBS før du tilsetter trypsin sikrer enkel separasjon av celler fra kolbeoverflaten. - Fjern PBS og tilsett 5 ml trypsin-EDTA-oppløsning til kolben. Inkuber kolben i 5 minutter ved 37 °C i en inkubator som inneholder 5% CO2.
- Samle supernatanten i røret og sentrifuge ved 1 500 x g i 5 minutter. Etter sentrifugering, fjern supernatanten og tilsett 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS til røret ved pipettering.
- Overfør cellene til en større kolbe og fortsett kulturen ved å legge til DMEM-F12 + 10% FBS til tilstrekkelige eksosomer er oppnådd35.
MERK: Dyrkningsceller fryses med en tetthet på 1 million / ml med 10% dimetylsulfoksid (DMSO) og lagres ved -80 ° C.
2. Produksjon av eksosomer fra Whartons Jelly mesenkymale stamceller
MERK: Exosomer er isolert fra dyrkede WJ-MSCer. Eksosomisolering utføres når celler dekker kolbeoverflaten og når omtrent 80% tetthet.
- Fjern supernatantmediet som inneholder 10 % FBS fra kolben og vask cellene med 5 ml PBS. Tilsett serumfritt DMEM-F12-medium til cellene etter skylling med PBS. Inkuber flasker i 48 timer ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator. Etter inkubering samles det serumfrie mediet i røret og oppbevares ved -20 °C.
MERK: I trinn 2.1 samles 180 ml serumfritt medium opp og lagres ved -20 °C. Etter tining startes en batchsentrifugeringsprosess, som beskrevet nedenfor. - Isolering av eksosomer
- Sentrifuger det oppsamlede serumfrie mediet ved 300 x g i 10 minutter ved +4 °C. Trekk forsiktig ut supernatanten og overfør den til et annet rør.
- Sentrifuge den oppsamlede supernatanten ved 2000 × g i 10 minutter ved +4 °C. Trekk forsiktig ut supernatanten og overfør den til et annet rør.
- Sentrifuger den oppsamlede supernatanten ved 10 000 × g i 30 minutter ved +4 °C. Trekk forsiktig ut supernatanten og overfør den til et annet rør.
- Overfør den oppsamlede supernatanten til ultrasentrifugerør og ultrasentrifuge ved 110 000 × g i 130 minutter. Fjern supernatanten langsomt og tilsett 1 ml PBS i pelleten.
- Virvel pelleten og ultrasentrifugen ved 110 000 × g i 70 minutter ved +4 °C36 (figur 1). Fjern supernatanten langsomt og tilsett 1 ml PBS i pelleten.
MERK: Etter at de ultrasentrifugeringstrinnene er fullført, kan de oppnådde eksosomene lagres ved -80 ° C. Den oppnådde pelleten er nå klar for karakterisering.
Figur 1: Eksosomisolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Karakterisering av eksosomer
- Analyse av nanopartikkelsporing (NTA)
MERK: Nanopartikkelsporingsanalyse utføres for å bestemme størrelsen og konsentrasjonen av de isolerte eksosomene. Tabletter som brukes til 1x PBS-oppløsning må ligge i området pH 7,3-7,5. 1x PBS-oppløsning inneholder 10 mM fosfatbuffer, 137 mM natriumklorid og 2,7 mM kaliumklorid. Løsningen fremstilles ved å tilsette 1 PBS tablett i 100 ml destillert vann. Denne forberedte løsningen steriliseres ved autoklavering.- Fortynn eksosomene 100 ganger ved å tilsette 990 μL PBS til 10 μL eksosomer. Ta den fortynnede suspensjonen inn i en engangssprøyte.
- Slå på NTA-enheten og koble til datamaskinen. Åpne programvaren.
- Injiser prøven i sprøyten inn i slangen i kassettdelen av enheten. Lukk kassettdekselet på enheten.
- I programvaren som åpnes, klikk på Start analyse-knappen . Lagre resultatene som er oppnådd ved å trykke på Record-knappen .
- Dynamisk lysspredningsanalyse
MERK: Eksosomer isolert for zetapotensial og størrelsesmåling fortynnes også på samme måte som for NTA-analyse.- Tilsett 980 μL PBS til 20 μL av eksosomene.
- Åpne zeta-størrelsesenheten og den tilkoblede datamaskinen. Åpne programvaren.
- Legg fjæringen fra trinn 3.2.1 til engangskuvetten. Åpne lokket på enheten, legg kyvetten i kassetten og lukk lokket.
- Velg kyvettetype i enhetens programvare. Klikk på Start analyse-knappen for zeta potensial og dimensjonsanalyse.
MERK: Analyser utføres separat for dimensjonsanalyse og zetapotensial.
4. Dopaminlasting i eksosomer
MERK: Etter at karakteriseringen av WJ-MSCs eksosomer er fullført, ble dopaminbelastede eksosomer oppnådd som et legemiddelleveringssystem. Legemiddellasting i eksosomer utføres ved bruk av inkubasjonsmetoden.
- Tilsett 3 ml PBS til eksosomsuspensjonen fra trinn 2.2.5. Steriliser den fortynnede suspensjonen ved filtrering ved hjelp av 0,22 μm filtre. Overfør 500 μL av den steriliserte eksosomsuspensjonen til et annet rør.
- Tilbered dopaminoppløsning (0,5 mg/ml) med destillert vann. Tilsett 500 μl dopaminoppløsning i rørene som inneholder eksosomene.
- Tilsett saponin i suspensjonen i trinn 4.2. Inkuber den tilberedte eksosom-dopamin-suspensjonen i 24 timer ved 37 °C.
MERK: Saponinkonsentrasjonen bør ikke overstige 0,002% av den totale oppløsningen. - Ultrasentrifuger suspensjonen ved 90 000 × g i 70 minutter for å fjerne fri dopamin og saponin fra mediet. Oppbevar de isolerte eksosomene ved -20 °C inntil bruk for videre analyse37.
MERK: Tilsett 0,02% askorbinsyre for stabiliteten til den tilberedte dopaminoppløsningen.
5. Karakterisering av dopaminbelastede eksosomer
- Analyse av sporing av nanopartikler (NTA)
MERK: Nanopartikkelsporingsanalyse utføres for å bestemme størrelsen og konsentrasjonen av isolerte eksosomer.- Følg trinn 3.1.1-3.1.4 for å fortynne eksosomene og utføre NTA.
- Dynamisk lysspredningsanalyse
MERK: Exosomer isolert for zeta-potensial og størrelsesmåling er også fortynnet på samme måte som NTA-analyse.- Følg trinn 3.2.1-3.2.4 for å fortynne eksosomene og utføre dynamisk lysspredningsanalyse.
MERK: Størrelse og zetapotensialer for hver løsning (saponin, dopamin, eksosom-dopamin) analyseres separat.
- Følg trinn 3.2.1-3.2.4 for å fortynne eksosomene og utføre dynamisk lysspredningsanalyse.
6. Væskekromatografi med høy ytelse (HPLC)
MERK: Mengdene dopamin lastet inn i eksosomer måles ved hjelp av HPLC-metoden (High Performance Liquid Chromatography). For å oppdage tilstedeværelsen av dopamin i den oppnådde formuleringen, detoneres eksosomer ved en spesiell prosess.
- Legg formuleringen i en 75 °C varmeovn for å fordampe. Tilsett acetonitril (50:50-forhold) til suspensjonen og virvelen. Sonikere løsningen i 10 minutter.
- Sentrifuger løsningen i 10 minutter ved 10 000 × g. Filtrer supernatanten gjennom et 0,22 μm filter.
- Analyser alle analytter ved hjelp av en C18-kolonne ved 30 °C ved en strømningshastighet på 1 ml / min (den mobile fasen H2O / acetonitril). Mål absorbansen ved 230 nm38.
7. Måling av legemiddelbelastningskapasitet (DL) og in vitro legemiddelfrigjøringskinetikk
- Kapasitet for legemiddelbelastning (DL)
MERK: Mengden dopamin som lastes inn i eksosomer, kvantifiseres ved hjelp av UV-Vis-spektroskopi. Absorbansen leses av ved 280 nm. De samlede supernatanter under syntese brukes til å måle mengden losset legemiddel. Dopaminkonsentrasjonen i supernatanten bestemmes via en standard kalibreringskurve for dopamin.- Lag en stamoppløsning på 1 mg/ml dopamin. Klargjør konsentrasjoner på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg/ml fra stamløsningen ved bruk av destillert vann.
MERK: Tilsett 0,02% askorbinsyre for stabiliteten til den tilberedte dopaminoppløsningen. - Generer en standard kalibreringskurve ved å måle absorbansen av hver fortynning av dopamin ved 280 nm i et UV-spektrofotometer.
- Mål absorbansen til supernatanten ved 280 nm.
- Beregn legemiddelbelastningskapasiteten for dopamin ved bruk av Eq (1) 39.
DL (%) =
100 (1)
MERK: Analysen utføres i tre eksemplarer.
- Lag en stamoppløsning på 1 mg/ml dopamin. Klargjør konsentrasjoner på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg/ml fra stamløsningen ved bruk av destillert vann.
- In vitro legemiddelfrigivelseskinetikk
MERK: Legemiddelfrigivelseskinetikk av dopaminbelastede eksosomer utføres ved bruk av en dialysemembran. PBS, pH 7,4, brukes som frigjøringsmedium for å simulere et fysiologisk mikromiljø.- Tilsett 1 ml dopaminbelastede eksosomer til dialysemembranen. Plasser membranen i et begerglass. Tilsett 15 ml PBS i begeret.
- Prøve 1 ml frigjøringsmedium i et beger ved 0,5, 1, 2, 4, 6 og 8 timer. På hvert tidspunkt, erstatt volumet av prøven med fersk PBS. Analysere prøvene tatt med bestemte intervaller ved 280 nm ved hjelp av et UV-Vis-spektrometer.
- Beregn resultatene ved hjelp av Eq (2) 40.
Publisering (%) =
100 (2)
MERK: En kalibreringskurve er utarbeidet for bestemmelse av in vitro legemiddelfrigjøringskinetikk. Dopaminoppløsning fremstilles ved 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 og 5,0 mg/ml konsentrasjoner. UV-absorbansverdien for hver konsentrasjon bestemmes til 280 nm med et UV-Vis-spektrofotometer.
100 (1)
100 (2)8. In vitro cytotoksisitetstest
- Revitalisering og kultur av fibroblaster
- Fjern fibroblastene fra fryseren ved -80 °C. Seed cellene i en kolbe som inneholder DMEM-F12 + 10% FBS.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en inkubator som inneholder 5% CO2. Endre kulturmediet hver 2.
- Pass cellene til de når 80% sammenløp. Følg trinn 1.3-1.5. Etter sentrifugering ved 1 500 × g i 5 minutter, fjern supernatanten, tilsett 1 ml DMEM-F12 + 10 % FBS og frø 10 000 celler per brønn i en 96 brønnplate.
- Tilsett DMEM-F12 medium + 10% FBS og inkuber cellene ved 37 ° C i 18 timer i en inkubator som inneholder 5% CO2. Bytt mediet av brønnene på slutten av inkubasjonen.
- Forbered lageret av dopaminbelastet eksosomsuspensjon. Fortynn den dopaminbelastede eksosomformuleringen med medium for å oppnå konsentrasjoner på 100 μL/ml, 250 μL/ml, 500 μL/ml og 1000 μL/ml.
- Legg de forberedte konsentrasjonene på cellene i hver brønn på 96-brønnplaten. Inkuber platene ved 37 ° C i 18 timer i en inkubator som inneholder 5% CO241.
- MTT-celle levedyktighetsanalyse
MERK: På slutten av inkubasjonen bestemmes levedyktighetsforholdene til celler ved MTT-testen.- Klargjør MTT-oppløsningen (5 mg/ml) med PBS. Tilsett 10 μL MTT-løsning til hver brønn. Inkuber i 4 timer ved 37 °C.
- På slutten av inkubasjonen, tilsett 100 μL DMSO til hver brønn. Inkuber platene i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Mål absorbansverdiene i ELISA-leseren ved 570 nm42,43.
MERK: MTT-levedyktighetstesten utføres i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksosomisolasjon og karakterisering
Wharton gelé stamceller dyrkes og inkuberes i et serumfritt medium i 48 timer når kulturen når tilstrekkelig tetthet. Etter endt inkubasjon lagres supernatanten ved -20 °C. De innsamlede supernatantene fortynnes med PBS og utsettes for ultrasentrifugering (figur 1). Den oppnådde løsningen analyseres ved NTA- og DLS-analyser. Eksosomene steriliseres ved å passere gjennom et 0, 22 μm filter. Den gjennomsnittlige størrelsen på de oppnådde eksosomene ble bestemt til å være 98 nm (Video 1). Omtrent 10 milliarder eksosompartikler ble oppnådd ved slutten av sentrifugeringen. Antallet nanopartikler avslørt av NTA- og DLS-analyser stemmer overens med hverandre. I tillegg ble zetapotensialet til eksosomer utgått fra WJ-MSC målt til -15,7 mV (figur 2 og figur 3).
Video 1: Nanopartikkelsporingsanalyse av Wharton Jelly-avledede eksosomer. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Lasting av dopamin i eksosomer
Som beregnet i NTA-analyse var det omtrent 1, 5 milliarder nanopartikler i 500 μL av de isolerte prøvene fra Whartons gelé. Dopaminoppløsning (5 mg/ml) ble blandet med 500 mikrol eksosomer, og suspensjonen ble inkubert i 24 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon ble den oppnådde løsningen karakterisert ved NTA- og DLS-analyser. Ifølge NTA-resultatene ble den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen til løsningen funnet å være 110 nm. En sammenligning av partikkelstørrelsene til eksosomer og dopaminbelastede eksosomer avslører at det var en signifikant økning i dimensjonene til de dopaminbelastede eksosomene. Antallet nanopartikler avslørt av NTA- og DLS-analyser var konsistente med hverandre. I tillegg ble zetapotensialet til dopaminbelastede eksosomer målt til -17,6 Mv (figur 2 og figur 3).
Video 2: Nanopartikkelsporingsanalyse av dopaminbelastede eksosomer. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
| Eksempel | Zeta-potensial |
| Eksosom | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponin | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamin | -14,4 mV ± 1,3 |
| Dopaminbelastet eksosom | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabell 1: Zeta-potensialet for alle løsninger.
DSL-analyser, Zeta-måleren og Zeta-potensialtabellen over dopamin-, saponin- og dopaminbelastede eksosomløsninger er vist i tabell 1.
Figur 2: Nanopartikkelsporingsanalyse av eksosomer. (A) Exosomer; (B) dopaminbelastede eksosomer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Zetasizer-analyse . (A) Eksosomer, (B) dopaminbelastede eksosomer, (C) Saponin, (D) Dopamin. Forkortelse: d = størrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilstedeværelsen av dopamin i løsningen ble bestemt ved HPLC-analyse. Dopaminbelastede eksosomer ble ultrasentrifugert og filtrert for å fjerne fritt dopamin. Hvis dopaminbelastning i eksosomer er vellykket ved slutten av inkubasjonen, kan den detekteres ved direkte måling av dopamin etter brudd på eksosomene. Til dette formål ble den dopaminbelastede eksosomsuspensjonen oppvarmet med damp, acetonitril tilsatt, og suspensjonen ble sonikert. Absorbans ble målt ved 230 nm for å vurdere mengden dopamin frigjort fra de forstyrrede eksosomene.
Figur 4: Tilstedeværelse av dopamin i formuleringen bestemt ved HPLC-analyse. Alle analyser ble utført med en C-18-kolonne med en mobil fase av H2O/acetonitril ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 30 °C. Absorbans måles ved 230 nm for å overvåke eluering av dopamin. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopaminbelastede eksosomer. Forkortelse: HPLC = væskekromatografi med høy ytelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som et resultat av HPLC-analyse ble den resulterende toppen for dopamin observert ved 6,45 min. Saponin ble også påvist etter eksosomfragmentering (figur 4).
Legemiddelbelastningskapasitet og in vitro legemiddelfrigivelseskinetikk
Dopaminbelastningskapasitet ble beregnet ved hjelp av UV-spektrofotometrimålinger og Eq (1) og Eq (2). Lastekapasitetsprosent ble funnet å være 10,89 ± 0,33. Den kumulative profilen for legemiddelfrigjøring er vist i figur 5. Legemiddelfrigivelseskinetikk overvåket i 8 timer viste at 74,8 % av innkapslet dopamin ble frigjort fra eksosomer innen de første 8 timene (figur 5).
Figur 5: Kumulativ profil for legemiddelfrigivelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
In vitro cytotoksisitetstest
Cytotoksisiteten til dopaminladede og frie eksosomer ble undersøkt på fibroblaster. Fibroblaster ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av formuleringer (100 μL / ml, 250 μL / ml, 500 μL / ml og 1000 μL / ml) og inkubert i 18 timer. Selv om dopaminbelastede eksosomer ikke viste noen bemerkelsesverdige cytotoksiske effekter, reduserte saponin tilsatt formuleringen for å øke innkapslingen av dopamin fibroblastlevedyktighet (p < 0,05, figur 6). Det var en økning i cellenes levedyktighet når fibroblastene ble behandlet med dopaminbelastede eksosomer opp til 500 μL / ml konsentrasjon. Ved slutten av 18-timers inkubasjonen ble cellenes levedyktighet bestemt av MTT-testen (figur 7). Den statistiske signifikansen av resultatene ble evaluert ved å utføre enveis ANOVA.
Figur 6: Mikroskopbilder (10x) etter inkubasjon av formuleringen med cellene. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopaminbelastede eksosomer 100 μL / ml, (D) Dopaminbelastede eksosomer 250 μL / ml, (E) Dopaminbelastede eksosomer 500 μL / ml, (F) Dopaminbelastede eksosomer 1000 μL / ml. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Statistisk analyse av MTT-levedyktighetstestresultater i celler inkubert i 18 timer med forskjellige konsentrasjoner av dopamin, saponin og dopaminbelastede eksosomer . (A) Cytotoksisitetsresultater, (B,C) Statistiske analyser. Forkortelser: D = Dopamin; S = Saponin; Exo-DA1 = Dopaminbelastede eksosomer 100 μL / ml; Exo-DA2 = Dopaminbelastede eksosomer 250 μL / ml; Exo-DA 3 Dopaminbelastede eksosomer 500 μL / ml; Exo-DA 4 = Dopaminbelastede eksosomer 1000 μL / ml; MTT = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I tillegg ble de cytotoksiske effektene av frie eksosomer også undersøkt på fibroblaster ved tilsvarende konsentrasjoner (figur 8). Før forsøket ble eksosomer fortynnet med PBS til 60 millioner partikler per ml. Deretter ble 10 μL, 25 μL, 50 μL og 100 μL av eksosomsuspensjonen tilsatt til hver brønn i en 96-brønnplate.
Figur 8: Statistisk analyse av MTT-levedyktighetstestresultater i celler inkubert i 18 timer med forskjellige konsentrasjoner av eksosomer . (A) Cytotoksisitetsresultater, (B,C) statistiske analyser. Forkortelser: EXO = eksosomer; MTT = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fibroblast levedyktighet ble funnet å være høyere med 500 μL / ml dopaminbelastede eksosomer og 25 μL / ml frie eksosomer sammenlignet med andre konsentrasjoner. Det ble imidlertid ikke observert noen signifikant cytotoksisitet ved noen konsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksosomer er små membranvesikler med dimensjoner på 40-200 nm som skilles ut av de fleste celletyper, for eksempel MSC1. I stand til å muliggjøre kommunikasjon mellom celler, kan eksosomer komme inn i celler på forskjellige måter som endocytose, fagocytose, mikropinocytose, lipidmediert internalisering og fusjon 33,44. Sammenlignet med andre nanobærersystemer, gir lipidene og kolesterolet som finnes på eksosomoverflaten evnen til å bære både hydrofile og hydrofobe molekyler, med hydrogenbindingen av kolesterolendene som tillater tett emballasje45.
Isoleringen av MSC-deriverte eksosomer, legemiddelbelastningseksperimenter og cytotoksisitetsanalyser ble utført i denne studien. Det er kjent at eksosomer har en viktig rolle i nevrogenese, spesielt i hjernen, i tillegg til deres betydelige funksjoner som last og kommunikasjon mellom celler 6,7. Videre er MSC-avledede eksosomer relativt godt tolerert, har iboende terapeutiske egenskaper, og viser høy stabilitet og homing evne46,47. I de senere år har forskning på nanoskala behandlingsmetoder som eksosomapplikasjoner tiltrukket seg stor oppmerksomhet som alternative behandlinger mot nevrodegenerative sykdommer, siden det ikke finnes noen kur mot disse lidelsene forårsaket av nevronskader. I tillegg gjør exosomers evne til å passere gjennom BBB dem gode plattformer som et narkotikabærersystem.
Selv om det finnes flere metoder for eksosomisolering, brukte vi her ultrasentrifugeisolasjonsmetoden, som er akseptert som en av de mest effektive metodene. I den nåværende studien er WJ-MSC, valgt som donorceller, kjent for sitt lave immunogene potensial47 og brukes som kilde til eksosomer i kliniske studier48. De oppnådde eksosomene ble deretter inkubert med dopaminoppløsning, hvor saponin tilsettes til løsningen for å øke suksessen med medikamentbelastning. På slutten av inkubasjonen ble fri dopamin og saponin fjernet fra mediet. Saponin forventes å selektivt fjerne det membranbundne kolesterolet av eksosomer og skape porer i de eksosomale lipid-dobbeltlagene, og fremme oppføringen av dopaminmolekyler. Som et resultat observeres det at dimensjonene til eksosomene økte noe, sannsynligvis på grunn av dopaminbelastning.
Zetapotensialet viser større elektrostatisk frastøting mellom partikler og deres tendens til å aggregere. Zetapotensialet for den oppnådde formuleringen var forenlig med resultatene fra tidligere studier49. I HPLC-analysen utført ved slutten av inkubasjonsperioden ble tilstedeværelsen av dopamin detektert etter fragmentering av eksosomene. Som nevnt ovenfor, saponin fremmer innkapsling av dopamin. Stoffets lastekapasitet ble målt med UV-vis-spektrofotometri basert på absorbansverdier39. Selv om inkubasjonsmetoden for legemiddelbelastning er enkel og billigere enn andre metoder, er lasteffektiviteten lav i denne metoden26. I denne studien var lastekapasiteten ca. 11%. Saponin er et effektivt permeabiliserende middel for cytoplasmatisk membran50 og ser ut til å øke lastekapasiteten til eksosomer med dopamin.
I fremtidige studier kan det være mer effektivt å foretrekke sonikeringsmetoden for å forbedre eksosomal legemiddelbelastningseffektivitet38. Den kumulative legemiddelfrigivelsesprofilen viste at store mengder dopamin ble frigjort ved slutten av 8 timers inkubasjon. En eksplosiv frigjøring ble observert i de første 5 timene av in vitro frisettingsstudien. Siden frigjøringsprofilen til eksosomformuleringer avhenger av mange parametere som legemiddelegenskaper, tolagsfluiditet og molekylvekt, kan forskjeller observeres i mengden frigjorte legemidler per time i mange studier51. I tillegg ble det ikke observert cytotoksiske effekter av formuleringene på fibroblaster i denne studien. Imidlertid ble den toksiske effekten av saponin tilsatt for å øke dopaminbelastningen i eksosomer detektert på fibroblastceller. Ifølge disse dataene er endogeniteten til eksosomer en naturlig og unik fordel sammenlignet med liposomer, mikrosfærer, mikroemulsjoner og andre syntetiske legemiddelleveringssystemer52. For å redusere ulempene ved dagens metode kan ulike transfeksjonsreagenser, elektroporasjonsteknikker eller endogene dopaminproduserende celler, fortrinnsvis genmodifiserte MSC, brukes som kilde til eksosomer.
Eksosomisolering ble utført med denne protokollen. Isolasjonstrinnet er imidlertid en veldig lang og vanskelig prosess. Det må utvises forsiktighet for å sikre at supernatanten samlet fra cellekultur er i det serumfrie mediet. I tillegg har mengden eksosomer hittil vært assosiert med proteinkonsentrasjon. Vi foreslår imidlertid at beregning og anvendelse av antall eksosompartikler kan bidra til å øke nøyaktigheten i kliniske studier. Inkubasjonsmetoden som ble brukt for legemiddelbelastning av isolerte eksosomer ble funnet å være lav når det gjaldt legemiddelbelastningskapasitet. Sonikeringsmetoden, som har høy stoffbelastningskapasitet, kan bidra til å oppnå mer effektive resultater.
Disse funnene viste at WJ-MSC-avledede eksosomer er kraftige bærere for dopaminlevering. Sammen med deres evne til å passere BBB og med deres immunmodulerende egenskaper, kan målrettede terapier for Parkinsons eller andre CNS-sykdommer utvikles med stoffbærende eksosomer. Studier bør imidlertid utføres in vivo og støttes med kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble primært støttet av forskningsmidler fra Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
