Summary
В этой статье представлена интеграция модуля спектральной фокусировки и импульсного лазера с двойным выходом, что позволяет быстро гиперспектральную визуализацию наночастиц золота и раковых клеток. Эта работа направлена на демонстрацию деталей мультимодальных нелинейных оптических методов на стандартном лазерном сканирующем микроскопе.
Abstract
Зондирование наночастиц золота (AuNPs) в живых системах имеет важное значение для выявления взаимодействия между AuNP и биологическими тканями. Кроме того, интегрируя нелинейные оптические сигналы, такие как стимулированное рамановское рассеяние (SRS), двухфотонная возбужденная флуоресценция (TPEF) и переходное поглощение (TA), в платформу визуализации, он может быть использован для выявления биомолекулярного контраста клеточных структур и AuNP мультимодальным способом. В этой статье представлена мультимодальная нелинейная оптическая микроскопия и она применяется для выполнения химически специфической визуализации AuNP в раковых клетках. Эта платформа визуализации обеспечивает новый подход к разработке более эффективных функционализированных AuNP и определению того, находятся ли они в сосудистом пространстве, окружающем опухоль, перицеллюлярном или клеточном пространстве.
Introduction
Наночастицы золота (AuNPs) показали большой потенциал в качестве биосовместимых зондов визуализации, например, в качестве эффективных поверхностных рамановских спектроскопических субстратов (SERS) в различных биомедицинских приложениях. Основные области применения включают такие области, как биозондирование, биовизуализация, поверхностно-усиленные спектроскопии и фототермическая терапия для лечения рака1. Кроме того, зондирование AuNP в живых системах имеет решающее значение для оценки и понимания взаимодействия между AuNP и биологическими системами. Существуют различные аналитические методы, в том числе инфракрасная спектроскопияс преобразованием Фурье (FTIR) 2, масс-спектрометрия с лазерной абляцией с индуктивной связью (LA-ICP-MS)3 и магнитно-резонансная томография (МРТ)4, которые успешно используются для исследования распределения AuNP в тканях. Тем не менее, эти методы страдают от ряда недостатков, таких как трудоемкость и сложная пробоподготовка3, требующая длительного времени сбора или отсутствие субмикронного пространственного разрешения 2,4.
По сравнению с обычными методами визуализации, нелинейная оптическая микроскопия предлагает несколько преимуществ для зондирования живых клеток и AuNP: нелинейная оптическая микроскопия достигает большей глубины изображения и обеспечивает внутреннюю возможность 3D-оптического сечения с использованием ближне-ИК-сверхбыстрых лазеров. Со значительным улучшением скорости визуализации и чувствительности обнаружения, двухфотонная возбужденная флуоресценция (TPEF)5,6,7 и вторая гармоническая генерация (SHG)8,9,10 микроскопия были продемонстрированы для дальнейшего улучшения неинвазивной визуализации эндогенных биомолекул в живых клетках и тканях. Кроме того, используя новые нелинейные оптические методы насоса-зонда, такие как переходное поглощение (TA)11,12,13,14 и стимулированное комбинационное рассеяние (SRS)15,16,17,18, можно получить безметочный биохимический контраст клеточных структур и AuNP. Визуализация AuNP без использования внешних меток имеет большое значение, поскольку химические возмущения наночастиц будут изменять их физические свойства и, следовательно, их поглощение в клетках.
Этот протокол представляет собой реализацию модуля Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) для двухволнового импульсного лазера, что позволяет быстро получать мультимодальную визуализацию AuNP и раковых клеток. Эта работа направлена на демонстрацию деталей интегрированных методов TPEF, TA и SRS на лазерном сканирующем микроскопе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Включение лазерной системы
- Включите систему блокировки и выберите лазер рычага перед запуском системы.
- Включите ПК с программным обеспечением для управления фемтосекундным лазером с двойным выходом.
- Загрузите программное обеспечение для фемтосекундного лазера с двойным выходом; это программное обеспечение позволяет включать и выключать лазер и непосредственно контролирует длину волны пучка накачки.
- Включите лазерное излучение, удерживая нажатой значок питания для подсчета 3.
- Подождите, пока лазер не прогреется и в программном обеспечении не загорится зеленый свет.
- Длина волны пучка насоса напрямую контролируется с помощью программного обеспечения; это может варьироваться от 680 до 1 300 нм. Для клеточной визуализации в рамановской колебательной области C-H выберите 802 нм.
- Откройте жалюзи перестраиваемого пучка насоса и луча Стокса 1045 нм, удерживая изображения диафрагмы в течение 3 с.
ВНИМАНИЕ: Лазерное безопасное наведение Фемтосекундный лазер с двойным выходом является инфракрасным импульсным лазером iv класса и может привести к необратимому повреждению зрения. Поэтому при проведении этой процедуры должны соблюдаться все местные правила лазерной безопасности: (i) Только авторизованные пользователи, прошедшие обучение по лазерной безопасности, могут проводить процедуру. (ii) Вход в лабораторию осуществляется через доступ с помощью карты с блокировкой на двери комнаты. iii) на протяжении большей части операции лазерные лучи полностью закрыты. (iv) При воздействии лазерного луча необходимо носить лазерные защитные очки (используйте лазерные защитные очки LG9, которые обеспечивают блокировку OD 7+ как накачки, так и лучей Стокса).
2. Включение блока синхронизации и рекомбинации спектральной фокусировки (SF-TRU)
- Загрузите программное обеспечение ATM на тот же ПК с лазерным программным обеспечением, которое управляет ступенями задержки и лазерными аттенюаторами в блоке SF-TRU.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это устройство отвечает за обеспечение пространственного перекрытия насоса и пучков Стокса, контролирует дисперсию в пучках насоса и Стокса и контролирует временную задержку между насосом и пучками Стокса. Поляризация пучков насоса и Стокса вертикальна. Обратите внимание, что каждый луч оснащен полуволновой пластиной для независимого управления поляризациями перед выходом из SF-TRU. - Убедитесь, что и накачка, и лазеры Стокса ослаблены до <10% (накачка) и <15% (лучи Стокса). Если лучи не ослаблены, мощность лазера может привести к повреждению системы и сжечь биологические образцы.
- Для клеточной визуализации установите оптимальные настройки лазера на 6% (насос) и 10% (Стокс), соответствующие 12 мВт и 30 мВт в образце.
- SF-TRU имеет две настройки: фемтосекундный (fs) режим и пикосекундный (ps) режим.
- Для режима fs нажмите на ручки по обе стороны от коробки (это удаляет дисперсионные решетки с пути луча).
- Для режима ps вытащите ручки по обе стороны от коробки (это помещает дисперсионные решетки в траекторию луча).
- Для гиперспектральной визуализации выберите режим ps.
- Убедитесь, что ступень задержки находится в правильном положении для насоса и пучков Стокса, которые будут временно перекрыты для визуализации C-H в этой системе.
- Убедитесь в правильности настроек дисперсии насоса и балки Стокса; для насоса 802 нм это 5 мм для пучка насоса и 30 мм для балки Стокса.
3. Модуляция луча Стокса для визуализации SRS
- Для обнаружения SRS модулируйте интенсивность луча Стокса.
- Включите генератор сигналов для модуляции луча.
- Вспомните предыдущие настройки, которые выглядят следующим образом:
ВЫХОД 1: Квадратная волна: Частота = 19,5 МГц, Амплитуда = 1,4 В.
ВЫХОД 2: Квадратная волна: Частота = 19,5 МГц, Амплитуда = 300 мВ. - Включите выходы 1 и 2.
- Подключите выход 1 к усилителю для EOM в коробке SF-TRU через кабель BNC.
- Подключите выход 2 к запирающему усилителю, используемому для обнаружения SRS , с помощью кабеля BNC.
- Включите питание усилителя на портале.
4. Включение блокирующего усилителя
- Для визуализации SRS используйте модуль обнаружения SRS, который содержит фотодиод большой площади и специально встроенный запирающий усилитель.
- Включите блок питания на блокируемом усилителе на портальном устройстве.
- Загрузите программное обеспечение для блокирующего усилителя "SRS detection Module" на ПК.
- В программе выбираются следующие настройки: Фаза = 0°, Смещение = -80 мВт, Усиление = 58 дБ.
- Выберите константу времени интеграции усилителя в программном обеспечении: для визуализации клеток постоянная времени 2 мкс дает изображения хорошего качества.
5. Работа на лазерном сканирующем микроскопе
- Включите вилки всего оборудования, кроме пульта дистанционного управления. Подождите, пока не загорится режим ожидания на блоке управления, расположенном в верхней части портала.
- Включите пульт дистанционного управления на портале и включите заднюю часть коробки. Подождите, пока индикатор пульта дистанционного управления не загорится (на блоке управления), и нажмите кнопку Запустить операцию.
- Включите ПК лазерного сканирующего микроскопа.
- Запустите программное обеспечение конфокального микроскопа.
- Проверьте световой путь микроскопа с помощью компьютерного программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В микроскоп были внесены некоторые изменения, чтобы сделать его пригодным для визуализации SRS: (i) В траектории луча в колесо фильтра, где лазерные лучи входят в блок сканирования, добавлен короткий проход 775 нм, который можно выбрать на вкладке Lightpath в компьютерном программном обеспечении. (ii) Вместо использования встроенных PMT конфокального микроскопа для обнаружения, к проходящему световому пути был добавлен индивидуальный детектор, который позволяет обнаруживать как SRS, так и CARS. iii) Выходы этих детекторов соединены с аналоговой коробкой на портале. Сигнал CARS от PMT подключается через кабель BNC к CD1, а сигнал SRS от запирающегося усилителя подключается через кабель BNC к CD2. - Управляйте фокусировкой с помощью сенсорного экрана, ручек дистанционного управления или программного обеспечения компьютера.
- Выберите нужные настройки изображения в программном обеспечении; это включает в себя масштабирование, размер изображения в пикселях и время ожидания пикселя.
- Убедитесь, что скорость изображения (время ожидания пикселя) больше, чем время интеграции, установленное в программном обеспечении с блокирующим усилителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации использовался водоиммерсионный объектив NA 1.2.
6. Установка образца на стадии микроскопа
- Подготовьте образцы клеток к визуализации следующим образом.
- Культивирование 4T1 клеток карциномы молочной железы мыши в RPMI-1640 дополнено 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Меняйте среду каждые 2 дня и проходите клетки при 70-80% слиянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрывки 8–10 использовались на протяжении всего хода экспериментов, описанных здесь. - Для экспериментов с визуализацией инкубируют 1 х 105 клеток на квадратных покровах в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2. Затем промыть клетки предварительно нагретым фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и инкубировать с наночастицами золота (разведение 1:100 в клеточной культуральной среде, концентрация запаса: 2,3 х 1010 частиц/мл, диаметр: 60 нм) в течение 4 ч.
- Перед визуализацией промыть клетки ледяным PBS и зафиксировать их 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Промойте ячейки с помощью PBS 3x, а затем установите между двумя крышками для визуализации.
- Культивирование 4T1 клеток карциномы молочной железы мыши в RPMI-1640 дополнено 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Меняйте среду каждые 2 дня и проходите клетки при 70-80% слиянии.
- Поместите каплю дистиллированной воды поверх объектива погружения в воду, который фокусирует лазерные лучи на образец между объективом и образцом. Затем поместите образец на ступень микроскопа.
- Конденсатор с NA 1.4 собирает свет, распространяемый вперед. Нанесите каплю воды между конденсатором и образцом для визуализации. Отрегулируйте высоту конденсатора примерно на 1 мм над образцом, чтобы собрать максимальное количество света.
- Детектор SRS находится на подвижном креплении, что позволяет ему скользить внутрь и из оптического пути сбора. Чтобы сфокусироваться на образце с помощью белого света, переместите детектор SRS с траектории луча.
- Поместите детектор обратно в траекторию луча, готовый к SRS-визуализации.
7. Изменение рамановского сдвига и сбор стека гиперспектральных данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Рамановское смещение, при котором происходит визуализация, зависит от положения стадии задержки в коробке SF-TRU и длины волны пучка накачки от лазерной системы.
- Для больших изменений в рамановском сдвиге измените длину волны лазера. Например, для визуализации колебаний CH между 2 800–3 100 см-1 выберите 802 нм, тогда как для визуализации около 1 600 см-1 для амидного пика I выберите пучок насоса на 898 нм. Отрегулируйте это с помощью программного обеспечения.
- Чтобы добиться небольших корректировок в рамановском сдвиге, сканируйте стадию задержки в блоке SF-TRU.
- SF-TRU задает положение ступени задержки в миллиметрах (мм). Чтобы преобразовать положение ступени задержки из мм в см-1, выполните калибровочное гиперспектральное сканирование с использованием образца полистирольных шариков и сравните пиковые положения, обнаруженные при калибровочном сканировании, с теми, которые были сделаны на спонтанной рамановской установке. Это обеспечит линейное уравнение, которое преобразует положение стадии задержки в мм в рамановский сдвиг в см-1.
- Чтобы создать гиперспектральное сканирование, сделайте временный ряд изображений в разных положениях стадии задержки.
- Чтобы синхронизировать получение изображения и движение ступени задержки, используйте аналоговый блок для отправки и приема сигналов TTL в систему SF-TRU и из нее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого аналоговая коробка имеет следующие соединения: (i) TRIG OUT VD1 — она подключается к SF-TRU через BNC и посылает сигнал TTL, чтобы сообщить шагу задержки с шагом +1. (ii) TRIG В 1 — здесь сигнал принимается через BNC, когда стадия задержки завершает свое движение, и это используется для запуска следующего изображения во временном ряду. - Для набора гиперспектральных данных выберите следующие параметры в программном обеспечении конфокального микроскопа:
- На вкладке Триггер выберите Запуск по триггеру TTL (ON) и Триггеру (каждый кадр).
- На вкладке Ряды установите временные ряды ВКЛ и Z ряд ВЫКЛ.
- Установите количество кадров во временном ряду в соответствии с количеством шагов в программном обеспечении банкомата (здесь используется 101 шаг).
- В программном обеспечении банкомата перейдите на вкладку Выполнить .
- Установите положения ступени задержки в миллиметрах для начала и остановки гиперспектрального сканирования. Для области высокого волнового числа СН используйте начальное положение = 90,25 мм и положение остановки = 92,25 мм.
- Убедитесь, что количество шагов совпадает с количеством кадров в программном обеспечении конфокального микроскопа.
- После проверки правильных настроек сначала запустите гиперспектральный стек в программном обеспечении конфокального микроскопа. Перейдите в раздел «Получить» и нажмите « Начать сканирование». Затем в программном обеспечении банкомата нажмите кнопку Пуск. Это инициирует сбор серии изображений с постепенным увеличением положения этапа задержки между выбранными начальными и стоповыми позициями.
- Экспортируйте серию гиперспектральных изображений в виде многокадрового .tif файла и используйте подходящий пакет программного обеспечения для проведения калибровки.
- После завершения калибровки используйте линейное калибровочное уравнение для преобразования положения стадии задержки в рамановские сдвиги.
- Для переключения между изображениями в колебательной области CH (2 800–3 100 см-1) и амидной вибрационной областью I 1 500–1 700 см-1) выполните следующие действия.
- Изменение длины волны накачки в лазерном программном обеспечении с 802 нм до 898 нм.
- Измените настройку дисперсии Стокса в программном обеспечении банкомата с 30 мм на 5 мм.
- Сделайте небольшую корректировку зеркала в пути рассеивания пучка насоса внутри коробки SF-TRU. Это делается путем регулировки нижней ручки на зеркальном креплении, которая изменяет угол зеркала на добавочную величину.
- При выполнении гиперспектрального сканирования над амидной областью I установите начальные и стоп-позиции в программном обеспечении банкомата на 89 и 91 мм соответственно.
ВНИМАНИЕ: Лазерные защитные очки должны быть надеты на этом этапе, так как лазерный луч будет открыт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модуль Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) введен между фемтосекундным лазером с двойным выходом и модифицированным лазерным сканирующим микроскопом. Перестраиваемая сверхбыстрая лазерная система, используемая в этом исследовании, имеет два выходных порта, доставляющих один луч на фиксированной длине волны 1045 нм, а другой луч настраивается в диапазоне 680-1 300 нм. Подробная схема модуля SF-TRU и мультимодальной платформы визуализации показана на рисунке 1. SF-TRU используется для щебетания двух фемтосекундных лазерных лучей до пикосекундных импульсов и перекрывает два луча пространственно и временно. Гиперспектральная стимуляция рамановского рассеяния (SRS) выполняется путем сканирования задержки между пикосекундным насосом и импульсами Стокса.
Все образцы освещаются импульсными лазерами через объектив с высокой числовой апертурой (NA) на модифицированном инвертированном микроскопе. Сигналы SRS и TPEF собираются в прямом направлении с помощью конденсатора с высоким NA. Для микроскопии SRS в качестве накачки и пучков Стокса используются перестраиваемые (680–1 300 нм) и фиксированные (1 045 нм) лазерные выходы. Комбинация фотодиода большой площади и запирающего усилителя используется для выполнения SRS-визуализации, в то время как луч Стокса блокируется двумя фильтрами (полосовые фильтры 890/210 и короткочастотные фильтры 950 нм). Важным преимуществом подхода спектральной фокусировки SRS по сравнению с пикосекундными лазерными системами является возможность настройки рамановского сдвига интереса, просто контролируя временную задержку между чирикающим насосом и импульсами Стокса. Этот подход позволяет быстро зондировать рамановские сдвиги в диапазоне нескольких сотен волновых чисел без изменения длин волн насоса и стокса, что позволяет гораздо быстрее гиперспектральную визуализацию.
Чтобы проверить производительность спектрального разрешения и химической селективности, образец микросфер полистирола (PS) сначала визуализируется (рисунок 2). Мощность лазера на образце (после 60-кратного водомерного объектива NA 1.2) составляет 10 мВт для луча Стокса 1045 нм и 20 мВт для пучка накачки 802 нм. Спектр SRS может быть извлечен в каждый пиксель в кадрах. На рисунке 2B показан гиперспектральный спектр SRS бусин PS. Для сравнения, спонтанный рамановский спектр бусин PS показан на рисунке 2А. SRS и спонтанные рамановские спектры микросфер PS почти идентичны, за исключением относительных различий интенсивности по бокам. Эти спектроскопические измерения позволяют преобразовывать стадию оптической линии задержки (мм) в рамановские волновые числа (см-1) для визуализации SRS.
Поскольку рамановские спектры основных биомолекул в колебательной полосе растяжения углерода и водорода находятся в диапазоне 2 800–3 050 см−1, SRS-визуализация раковых клеток 4T1 выполняется при 2 852 см−1 (липид), 2 930 см−1 (белок), 2 968 см−1 (ДНК) и наложении изображений, как показано на рисунке 3. Изображения SRS различных рамановских диапазонов получаются со временем ожидания пикселя 4 мкс при размере кадра 512 x 512 пикселей.
Наконец, этот метод еще больше распространился на мультимодальную визуализацию раковых клеток 4T1, дозированных наночастицами золота (AuNP), что позволило нам более точно изобразить распределение AuNP в раковых клетках. Полученные изображения SRS (каналы CH2 и CH3 ), TPEF (флуоресцентные зонды LysoTracker) и TA (внерезонансный канал SRS) изображены на рисунке 4.
Рисунок 1: Схема гиперспектральной мультимодальной платформы визуализации. Иллюстрация мультимодальной нелинейной оптической микроскопии. DM, дихроичное зеркало; DS, стадия задержки; EOM, электрооптический модулятор; FG, генератор функций; FL, фильтр; G, решетка; LIA, блокирующий усилитель; М, зеркало; OBJ, цель; PD, фотодиод; ПМТ, фотоумножительная трубка; SF-TRU, синхронизация спектральной фокусировки и блок рекомбинации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Спектры микросфер полистирола (ПС). Спонтанный (A) рамановский спектр микросфер PS демонстрирует хорошее согласие с (B) гиперспектральным спектром SRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Спектроскопическая SRS-визуализация раковых клеток 4T1. Изображения SRS размером 2 852 см−1, 2 930 см−1, 2 968 см−1 и наложенное изображение. Шкала: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Мультимодальная визуализация поглощения наночастиц золота раковыми клетками 4T1. Гиперспектральные изображения SRS при 2 852 см−1 (CH2), 2 928 см−1 (CH3), 3 080 см−1 (вне резонанса, остался только сигнал TA), TPEF и наложенное изображение. Шкала: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование представило комбинацию модуля SF-TRU и сверхбыстрой лазерной системы с двойным выходом, продемонстрировав ее применение для мультимодальной микроспектроскопии. Благодаря своей способности исследовать поглощение наночастицами золота (AuNPs) раковыми клетками, мультимодальная платформа визуализации может визуализировать клеточные реакции на гипертермическое лечение рака, когда лазерные лучи поглощаются AuNP.
Кроме того, быстрая химически специфическая визуализация и высокое спектральное разрешение достигаются за счет использования метода спектральной фокусировки, используя два набора пар решеток для управления щебетанием в каждом лазерном луче. По сравнению с использованием стеклянных стержней фиксированной длины для щебетания, пары решеток позволяют сопоставить спектральное разрешение и ширину линий интересующих раманов линий19.
Кроме того, эту систему можно легко переключать с фемтосекундного на чирикающий пикосекундный режимы с помощью специально разработанных ручных ползунков для удаления решеток с траекторий луча, не влияя на выравнивание внутри микроскопа. Для достижения высокой чувствительности и спектрального разрешения SRS обычно реализуется с использованием узкополосного пикосекундного насоса и импульсов Стокса. Однако пикосекундных лазеров недостаточно для многофотонного возбуждения, требующего более высоких пиковых уровней мощности, которые достижимы с фемтосекундными лазерами. Мультимодальные возможности позволяют использовать этот метод для различных применений, таких как многофотонная визуализация20, когерентное рамановское рассеяние21 и спектроскопия насосно-зондовая.
Существует несколько стратегий, которые могут быть использованы для дальнейшего повышения производительности демонстрируемого устройства. Например, более быстрая моторизованная стадия линии задержки и программное обеспечение для сбора данных предлагают более высокую скорость обработки изображений, что может увеличить пропускную способность мультимодальной платформы визуализации. Кроме того, текущая установка охватывала ~300 см−1 спектрального диапазона со спектральным разрешением до 5 см−1. Для дальнейшего расширения спектрального диапазона для гиперспектральной микроскопииSRS 22 была использована модифицированная лазерная система с более широкой спектральной полосой пропускания.
В совокупности эта мультимодальная и неинвазивная платформа визуализации дает новое представление о наномедицине и открывает новый путь к мультимодальной молекулярной визуализации клеток, биологических тканей и наночастицс высоким содержанием 23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами EPSRC: рамановская нанотеранотика (EP/R020965/1) и установка CONTRAST (EP/S009957/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735 (2019).
- Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
