यहां, हम जीन कार्यों के अध्ययन की सुविधा के लिए बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस में आरएनए हस्तक्षेप की एक विस्तृत भिगोने की विधि पेश करते हैं।
पाइनवुड नेमाटोड, बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस, दुनिया भर में सबसे विनाशकारी आक्रामक प्रजातियों में से एक है, जिससे देवदार के पेड़ों की मुरझाने और अंतिम मृत्यु हो जाती है। उनके आर्थिक और पर्यावरणीय महत्व की मान्यता के बावजूद, पारंपरिक फॉरवर्ड जेनेटिक्स और ट्रांसजेनिक विधियों का उपयोग करके पौधे-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) के विस्तृत जीन कार्यों का अध्ययन करना अब तक असंभव रहा है। हालांकि, एक रिवर्स जेनेटिक्स तकनीक के रूप में, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) नेमाटोड के कार्यात्मक जीन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें बी।
यह पत्र बी ज़ाइलोफिलस में पीपीएम -1 जीन के आरएनएआई के लिए एक नए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है, जिसे अन्य रोगजनक नेमाटोड के विकास और प्रजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की सूचना दी गई है। आरएनएआई के लिए, टी 7 प्रमोटर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा लक्ष्य टुकड़े के 5′-टर्मिनल से जुड़ा हुआ था, और डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित किया गया था। इसके बाद, डीएसआरएनए डिलीवरी सिंथेटिक न्यूरोस्टिमुलेंट के साथ मिश्रित डीएसआरएनए समाधान में नेमाटोड को भिगोकर पूरा किया गया था। जाइलोफिलस (लगभग 20,000 व्यक्तियों) के सिंक्रनाइज़ किशोरों को धोया गया और 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 24 घंटे के लिए भिगोने वाले बफर में डीएसआरएनए (0.8 μg /
नेमाटोड की समान मात्रा को नियंत्रण के रूप में डीएसआरएनए के बिना भिगोने वाले बफर में रखा गया था। इस बीच, नेमाटोड की एक और समान मात्रा को नियंत्रण के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जीन डीएसआरएनए के साथ भिगोने वाले बफर में रखा गया था। भिगोने के बाद, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके लक्ष्य टेपों की अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किया गया था। आरएनएआई के प्रभावों की पुष्टि तब फेनोटाइप के सूक्ष्म अवलोकन और समूहों के बीच वयस्कों के शरीर के आकार की तुलना का उपयोग करके की गई थी। वर्तमान प्रोटोकॉल जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से नियंत्रण रणनीतियों को विकसित करने की दिशा में बी ज़ाइलोफिलस और अन्य परजीवी नेमाटोड के जीन के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए अनुसंधान को आगे बढ़ाने में मदद कर सकता है।
पादप-परजीवी सूत्रकृमि (पीपीएन) खाद्य सुरक्षा और वन पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए एक निरंतर खतरा है। वे हर साल आर्थिक नुकसान में अनुमानित 100 बिलियन अमरीकी डालर का कारण बनते हैं, जिनमें से सबसे अधिक समस्याग्रस्त मुख्य रूप से रूट-गाँठ नेमाटोड, पुटी नेमाटोड और पाइनवुड नेमाटोड हैं। पाइनवुड नेमाटोड, बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस, एक प्रवासी, एंडोपैरासिटिक नेमाटोड है, जो पाइन विल्ट रोग2 का कारण रोगज़नक़ है। इसने दुनिया भर में देवदार के जंगलों को बहुत नुकसान पहुंचायाहै 3. वान मेगन एट अल 4 की शब्दावली का उपयोग करते हुए, बी ज़ाइलोफिलस पैरासिटाफेलेनचिडा का सदस्य है और क्लेड 10 से संबंधित है, जबकि अधिकांश अन्य प्रमुख पौधे परजीवी क्लेड 12 से संबंधित हैं।
एक स्वतंत्र और हाल ही में विकसित पौधे परजीवी के रूप में, बी ज़ाइलोफिलस तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल है। आज तक, क्लैड 12 से संबंधित रूट-गाँठ नेमाटोड और पुटी नेमाटोड पर पर्याप्त शोध किया गया है, जो बाध्यकारी, गतिहीन एंडोपारासाइट्स हैं और कुछ सबसे गहन अध्ययन किए गए नेमाटोड हैं। हालांकि, इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में आगे के शोध का संचालन एक बड़ी चुनौती के साथ आता है: परजीवीजीन का कार्य एक शोध अड़चन है। कार्यात्मक अध्ययनों में आम तौर पर एक्टोपिक अभिव्यक्ति और नॉकडाउन / आउट प्रयोग शामिल होते हैं लेकिन नेमाटोड के लिए प्रभावी आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं। नतीजतन, पीपीएन में रिवर्स जेनेटिक्स लगभग विशेष रूप से आरएनएआई द्वारा जीन साइलेंसिंग पर निर्भर करता है।
आरएनएआई, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से मौजूद एक तंत्र, डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) 5 को पेश करके जीन अभिव्यक्ति को चुप करता है। आज तक, डीएसआरएनए द्वारा प्रेरित पोस्टट्रांसक्रिप्शनल जीन-साइलेंसिंग तंत्र सभी अध्ययन किए गए यूकेरियोट्स में पाया गया है, और आरएनएआई प्रौद्योगिकी, कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान और अन्य अनुप्रयोगों के एक उपकरण के रूप में, कई जीवों में तेजी से विकसित हुई है। 19986 में कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में आरएनएआई मशीनरी की खोज के बाद से, आरएनएआई तकनीक नेमाटोड के जीन फ़ंक्शन की पहचान करने के लिए प्रभावी तरीके बन गए हैं और रोगजनक नेमाटोड7 को प्रभावी ढंग से नियंत्रित करने के एक नए तरीके के रूप में प्रस्तावित हैं।
आरएनएआई तकनीकी रूप से डीएसआरएनए में किशोरों को भिगोना पर्याप्त हो सकता है; हालाँकि, इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता और प्रजनन क्षमता नेमाटोड प्रजातियों और लक्ष्य जीन 8 के साथ व्यापक रूप से भिन्न होतीहै। रूट-गाँठ सूत्रकृमि के आरएनएआई मार्गों में शामिल 20 जीनों की चुप्पी, मेलोइडोगिन गुप्त, ट्रिगर्स के रूप में लंबे डीएसआरएनए का उपयोग करके जांच की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिक्रियाएं हुईं, जिनमें वृद्धि और कुछ जीनों की अभिव्यक्ति में कोई बदलाव नहीं हुआ9. इन परिणामों से पता चलता है कि लक्ष्य जीन आरएनएआई नॉकडाउन का अलग-अलग जवाब दे सकते हैं, जिससे आरएनएआई के माध्यम से नेमाटोड नियंत्रण के लक्ष्य के रूप में उनकी उपयुक्तता के संपूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। हालांकि, वर्तमान में विकासात्मक और प्रजनन जीव विज्ञान पर अनुसंधान की कमी है बी।
पिछले काम10,11,12,13 की निरंतरता के रूप में, हम यहां बीएसआरएनए, सिंथेटिक न्यूरोस्टिमुलेंट भिगोने और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) का पता लगाने के संश्लेषण सहित बी ज़ाइलोफिलस के पीपीएम -1 जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए आरएनएआई को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से प्राप्त ज्ञान संभवतः बुनियादी जैविक प्रणालियों को समझने और पाइन विल्ट रोग को रोकने में स्पष्ट रूप से योगदान देगा।
यद्यपि बी ज़ाइलोफिलस का जीवन इतिहास और परजीवी वातावरण अन्य नेमाटोड से अलग है, इस पौधे रोगज़नक़ के आणविक रोगजनन पर सीमित शोध हुआ है। सी एलिगेंस और अन्य नेमाटोड में सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीनोम संपाद…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31870637, 31200487) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और झेजियांग कुंजी अनुसंधान योजना (2019सी02024, एलजीएन 22 सी 160004) द्वारा संयुक्त रूप से वित्त पोषित किया गया था।
Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |