Müller glia primære kulturer opnået fra musens nethinder repræsenterer et meget robust og pålideligt værktøj til at studere gliakonverteringen til retinale stamceller efter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinationer kan testes før deres efterfølgende anvendelse af in vivo-tilgange .
Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden og kan fungere som en regenerativ kilde til retinale neuroner. I lavere hvirveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturligt; hos pattedyr er stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation imidlertid påkrævet. Da MG kun udgør 5% af retinal cellepopulationen, er der behov for modelsystemer, der udelukkende tillader undersøgelse af denne cellepopulation. Et af disse modelsystemer er primære MG-kulturer, der er reproducerbare og kan bruges til en række forskellige applikationer, herunder molekyle / faktor screening og identifikation, test af forbindelser eller faktorer, celleovervågning og / eller funktionelle tests. Denne model bruges til at studere potentialet af murine MG til at konvertere til retinale neuroner efter tilskud eller hæmning af microRNA’er (miRNA’er) via transfektion af kunstige miRNA’er eller deres hæmmere. Brugen af MG-specifikke reportermus i kombination med immunofluorescerende mærkning og enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) bekræftede, at 80% -90% af cellerne, der findes i disse kulturer, er MG. Ved hjælp af denne model blev det opdaget, at miRNA’er kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC’er), som efterfølgende differentierer sig til neuronallignende celler. Fordelene ved denne teknik er, at miRNA-kandidater kan testes for deres effektivitet og resultat, før de anvendes i in vivo-applikationer .
Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden. De har lignende funktioner sammenlignet med andre glia i andre dele af centralnervesystemet, såsom at opretholde vand og ionhomeostase, nærende neuroner og beskytte vævet. MG har en anden fascinerende funktion: selvom de er modne glia, udtrykker de stadig mange gener udtrykt i retinale stamceller (RPC’er) under sen udvikling 1,2. Denne lighed antages at være årsagen til den naturligt forekommende MG-baserede neuronale regenerering i fiskehinden efter retinal skade 3,4. Under denne proces går MG ind i cellecyklussen igen og dedifferentierer i RPC’er, der derefter differentieres til alle seks typer retinale neuroner. Selvom dette fænomen forekommer naturligt i fisk, omdannes pattedyr MG ikke til neuroner 5,6. De kan dog omprogrammeres. En række faktorer har vist sig at omprogrammere MG til RPC’er / neuroner; blandt disse faktorer er den grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der er involveret i fiskeregenerering 7,8. Hos mus udtrykkes Ascl1 kun i RPC’er under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale neuroner9.
Omprogrammering af celler direkte in vivo er ikke kun metodisk udfordrende, men kræver også godkendelse fra et institutionelt dyrepleje- og brugsudvalg. For at opnå godkendelse kræves foreløbige data om den eller de anvendte eller ændrede faktorer, koncentrationer, virkninger uden for målet, underliggende mekanismer, toksicitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillader test af disse kriterier før brug i in vivo-modeller. Da MG desuden kun udgør ca. 5% af hele retinal cellepopulation10, tillader MG-kulturer undersøgelse af deres funktion11 såvel som deres adfærd, herunder migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skade / skade15,16, deres interaktion med andre celletyper såsom microglia17 eller retinale ganglionceller (RRGC’er)18, eller deres neurogene potentiale 19,20,21. Mange forskere bruger udødeliggjorte cellelinjer til deres studier, da de har et ubegrænset proliferativt potentiale og let kan vedligeholdes og transficeret. Primære celler foretrækkes imidlertid til biologisk relevante assays end udødeliggjorte celler, da de har sande celleegenskaber (gen- og proteinekspression), og endnu vigtigere repræsenterer de et bestemt udviklingsstadium og har derfor en “alder”. Et dyrs alder (og følgelig af de celler, der er opnået fra et dyr) er en særlig afgørende faktor i cellulær omprogrammering, da celle plasticitet reduceres med fremskreden udviklingsstadium22.
Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA’er som en aktuel in vitro-metode til undersøgelse af regenerering. Denne MG primære kulturmodel blev etableret i 2012 for at evaluere celleproliferationsegenskaber for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det blev vist, at dyrket MG opretholder deres gliaegenskaber (dvs. ekspression af S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evalueret via immunofluorescerende mærkning), og at de ligner in vivo MG (mikroarray af FACS-renset MG)23. Kort tid derefter blev gliamRNA og proteinekspression valideret og bekræftet i en anden tilgang ved hjælp af virale vektorer20. Et par år senere blev det bekræftet, at langt de fleste celler, der findes i disse kulturer, er MG ved hjælp af mg-specifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Desuden viste kvantificeringen af sættet af miRNA’er i både FACS-renset MG og dyrket primær MG, at niveauerne af MG miRNA’er (mGLiomiRs) ikke varierer meget i dyrket MG i vækstfasen. Langstrakte dyrkningsperioder forårsager imidlertid ændringer i miRNA-niveauer og følgelig i mRNA-niveauer og proteinekspression, da miRNA’er er translationelle regulatorer25.
I 2013 blev denne MG-kulturmodel brugt til at teste en række transkriptionsfaktorer med hensyn til deres evne til at omprogrammere MG til retinale neuroner20. Ascl1 viste sig at være en meget robust og pålidelig omprogrammeringsfaktor. Overekspression af Ascl1 via virale vektorer inducerede morfologiske ændringer, ekspression af neuronale markører og erhvervelse af neuronale elektrofysiologiske egenskaber. Endnu vigtigere er det, at den indsigt og de resultater, der blev opnået fra disse første in vitro-forsøg, med succes blev overført til in vivo-applikationer 22,26, hvilket viser, at primære MG-kulturer repræsenterer et solidt og pålideligt værktøj til indledende faktorscreeninger og evaluering af gliale træk inden in vivo-implementering.
For et par år siden blev det vist, at det hjerneberigede miRNA miR-124, som også er stærkt udtrykt i retinale neuroner, kan inducere Ascl1-ekspression i dyrket MG21. Ascl1-ekspression i levende celler blev visualiseret via en Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en gensplejset mus, der har et reportergen indsat i sit DNA. Dette reportergen koder for et reporterprotein, som i dette studie er tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Denne reporter protein rapporterer ekspressionen af et gen af interesse, i dette tilfælde Ascl1. Med andre ord bliver celler, der udtrykker Ascl1 , røde. Da Ascl1 kun udtrykkes i RPC’er9, tillader denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus sporing af MG-konvertering til Ascl1 , der udtrykker RPC’er, hvilket betyder, at konverterende celler vil udtrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel mærkning, da DNA’et i disse celler ændres. Følgelig vil enhver efterfølgende neuronal differentiering blive visualiseret, fordi tdTomato-etiketten forbliver i differentierende celler. Hvis Ascl1 , der udtrykker MG-afledte RPC’er (med tdTomato-etiket), differentieres til neuroner, vil disse neuroner stadig have deres røde etiket. Denne mus tillader derfor ikke kun mærkning af MG-afledte RPC’er til levende cellebilleddannelse, men tillader også skæbnekortlægning og afstamning af disse MG-afledte (røde) RPC’er. For nylig blev sættet af miRNA’er i RPC’er identificeret, og MG-kulturer af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus blev brugt til at screene og teste effekten af disse miRNA’er på omprogrammeringskapacitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, blev fundet i stand til at omprogrammere dyrket MG til Ascl1-ekspressive (Ascl1-Tomato+) celler. Disse omprogrammerede celler vedtager neuronale træk over tid, herunder neuronal morfologi (små somata og enten korte eller lange fine processer), ekspression af neuronale transkripter målt via scRNA-Seq samt ekspression af neuronale proteiner valideret via immunofluorescerende mærkning27.
Her beskriver protokollen, hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra det tidligere arbejde 21,24,27. Valgt til denne protokol er den førnævnte miRNA miR-25, et miRNA stærkt udtrykt i RPC’er, med lave ekspressionsniveauer i MG eller retinale neuroner. For at overudtrykke miR-25 efterligner murine miR-25, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som kontrol vælges efterligninger af et miRNA fra Caenorhabditis elegans, der ikke har nogen funktion i pattedyrceller. Visualisering af konverteringen af MG til RPC’er blev udført via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet baggrund (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne dyrkning kan dog udføres med alle musestammer, herunder vildstammer. I de sidste par år er den oprindelige protokol blevet ændret for at reducere vækstfasevarigheden og den samlede kulturperiode og sikre en mere robust gliacellestatus og minimere graden af cellulær degeneration, som forekommer i længere dyrkningsperioder. Det almindelige transfektionstidsvindue blev også forlænget fra 3 timer til 2 dage. Som tidligere nævnt, selvom den nuværende protokol beskriver MG-kulturer som et værktøj til regenereringsundersøgelser, er metoden ikke kun nyttig til test af omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses til andre applikationer, herunder undersøgelser om MG-migrerende eller proliferativ adfærd, skade / celleskaderelaterede paradigmer og / eller identifikation af underliggende mekanismer og veje.
Denne protokol beskriver, hvordan man dyrker MG fra dissocierede musehinden til omprogrammering af undersøgelser ved hjælp af miRNA’er. Som vist og bekræftet i en række tidligere undersøgelser er langt størstedelen (80%-90%) af cellerne, der findes i disse kulturer, MG 20,23,24. Denne metode er en meget robust og pålidelig teknik, og resultaterne kan let gengives, hvis protokollen følges korrekt21,27</s…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres input til manuskriptet. Særlig tak går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for at introducere MG primære kulturer som et screeningsværktøj til S.G.W. under postdoktoruddannelse ved University of Washington i Seattle. Undersøgelsen blev finansieret af Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og opstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W. samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.
Animals | |||
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
Reagents | |||
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
plasticware/supplies | |||
0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
equipment | |||
1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |