Summary

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

Published: March 28, 2022
doi:

Summary

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ”א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

Abstract

Müller glia (MG) הם הגליה השולטת ברשתית העצבית ויכולים לתפקד כמקור רגנרטיבי לנוירונים ברשתית. אצל בעלי חוליות נמוכים יותר כגון דגים, התחדשות מונעת MG מתרחשת באופן טבעי; ביונקים, לעומת זאת, נדרש גירוי עם גורמים מסוימים או מניפולציה גנטית/אפיגנטית. מכיוון ש-MG מהווה רק 5% מאוכלוסיית תאי הרשתית, יש צורך במערכות מודל המאפשרות לחקור את אוכלוסיית התאים הזו באופן בלעדי. אחת ממערכות המודל הללו היא תרביות MG ראשוניות הניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן למגוון יישומים, כולל סינון וזיהוי של מולקולות/גורמים, בדיקת תרכובות או גורמים, ניטור תאים ו/או בדיקות פונקציונליות. מודל זה משמש לחקר הפוטנציאל של מורין MG להמיר לנוירונים ברשתית לאחר תוספת או עיכוב של מיקרו-רנ”א (miRNA) באמצעות טרנספקציה של miRNA מלאכותיים או מעכביהם. השימוש בעכברי דיווח ספציפיים ל-MG בשילוב עם תיוג אימונופלואורסצנטי וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אישר כי 80%-90% מהתאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG. באמצעות מודל זה, התגלה כי miRNAs יכולים לתכנת מחדש את MG לתאי אב רשתית (RPCs), אשר לאחר מכן מתמיינים לתאים דמויי נוירונים. היתרונות של טכניקה זו הם שניתן לבחון מועמדים ל-miRNA על יעילותם ותוצאתם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo .

Introduction

גליה מולר (באנגלית: Müller glia) היא הגליה השולטת ברשתית העצבית. יש להם תפקודים דומים בהשוואה לגליה אחרים בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים, הזנת נוירונים והגנה על הרקמה. ל-MG יש תכונה מרתקת נוספת: למרות שהם גליה בוגרים, הם עדיין מבטאים גנים רבים המתבטאים בתאי אב רשתית (RPCs) במהלך התפתחות מאוחרת 1,2. ההנחה היא שדמיון זה הוא הסיבה להתחדשות העצבית הטבעית המבוססת על MG ברשתית הדגים לאחר נזק לרשתית 3,4. במהלך תהליך זה, MG נכנסת מחדש למחזור התאים ומתמיינת מחדש ל-RPCs שלאחר מכן מתמיינים לכל ששת הסוגים של נוירוני הרשתית. למרות שתופעה זו מתרחשת באופן טבעי בדגים, יונקים MG אינם ממירים לנוירונים 5,6. עם זאת, ניתן לתכנת אותם מחדש. הודגם כי מגוון גורמים מתכנתים מחדש את MG ל-RPCs/נוירונים; בין גורמים אלה נמצא גורם השעתוק הבסיסי סליל-לולאה-סליל (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) המעורב בהתחדשות דגים 7,8. בעכברים, Ascl1 מתבטא רק ב-RPCs במהלך רטינוגנזה, אך הוא נעדר ב-MG בוגר או בתאי עצב ברשתית9.

תכנות מחדש של תאים ישירות in vivo הוא לא רק מאתגר מבחינה מתודולוגית, אלא גם דורש אישור מוועדה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. כדי לקבל אישור, נדרשים נתונים ראשוניים על הגורמים שבהם נעשה שימוש או שינוי, ריכוזים, השפעות מחוץ למטרה, מנגנונים בסיסיים, רעילות ויעילות. מערכות תרביות תאים מאפשרות בדיקה של קריטריונים אלה לפני השימוש במודלים in vivo. יתר על כן, מכיוון ש-MG מהווים רק כ-5% מכלל אוכלוסיית תאי הרשתית10, תרביות MG מאפשרות לחקור את תפקודן11 וכן את התנהגותן, כולל נדידה12,13, התפשטות14, תגובת עקה לפציעה/נזק15,16, האינטראקציה שלהן עם סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה17 או תאי גנגליון רשתית (RGCs)18, או הפוטנציאל הנוירוגני שלהם 19,20,21. חוקרים רבים משתמשים בקווי תאים מונצחים לצורך המחקרים שלהם מכיוון שיש להם פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל וניתן לתחזק אותם בקלות ולתמר אותם. תאים ראשוניים, לעומת זאת, עדיפים על מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית מאשר תאים מונצחים, שכן יש להם מאפייני תאים אמיתיים (ביטוי גנים וחלבונים), וחשוב מכך, הם מייצגים שלב מסוים בהתפתחות ולכן יש להם “גיל”. גילו של בעל חיים (וכתוצאה מכך של התאים המתקבלים מבעל חיים) הוא גורם מכריע במיוחד בתכנות מחדש של התאים, שכן הפלסטיות של התאים פוחתת עם התקדמות שלב ההתפתחות22.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתכנת מחדש MG ראשוני עם miRNAs כשיטת מבחנה נוכחית לחקר התחדשות. מודל תרבית ראשוני זה של MG הוקם בשנת 2012 כדי להעריך את מאפייני התפשטות התאים של MG בעכברי נוק-אאוט P53 (trp53-/- עכברים)23. הודגם כי MG מתורבתים שומרים על תכונות הגליה שלהם (כלומר, ביטוי של חלבוני S100β, Pax6 ו-Sox2 שהוערכו באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי), וכי הם דומים ל-in vivo MG (מיקרו-מערך של MG מטוהר FACS)23. זמן קצר לאחר מכן, mRNA גליאלי וביטוי חלבונים אומתו ואושרו בגישה שונה באמצעות וקטורים נגיפיים20. כמה שנים לאחר מכן, אושר כי הרוב המכריע של התאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG על ידי שימוש בעכבר Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter24 הספציפי ל-MG. יתר על כן, כימות של קבוצת ה-miRNAs הן ב-MG המטוהר ב-FACS והן ב-MG ראשי מתורבת הראה כי הרמות של MG miRNAs (mGLiomiRs) אינן משתנות הרבה ב-MG מתורבת במהלך שלב הצמיחה. עם זאת, תקופות תרבית מוארכות גורמות לשינויים ברמות ה-miRNA וכתוצאה מכך ברמות ה-mRNA ובביטוי החלבון, שכן miRNA הם מווסתים תרגומיים25.

בשנת 2013, מודל תרבית MG זה שימש לבדיקת מגוון גורמי שעתוק ביחס ליכולתם לתכנת מחדש את MG לנוירונים ברשתית20. Ascl1 נמצא כגורם תכנות מחדש חזק ואמין מאוד. ביטוי יתר של Ascl1 באמצעות וקטורים ויראליים גרם לשינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמנים עצביים ורכישת תכונות אלקטרופיזיולוגיות עצביות. חשוב מכך, התובנות והתוצאות שהתקבלו מניסויים ראשונים אלה במבחנה הועברו בהצלחה ליישומי in vivo 22,26, מה שמדגים כי תרבויות MG ראשוניות מייצגות כלי מוצק ואמין להקרנות גורמים ראשוניות ולהערכה של תכונות גליה לפני יישום in vivo.

לפני מספר שנים, הוכח כי miRNA miR-124 המועשר במוח, אשר מתבטא מאוד גם בתאי עצב ברשתית, יכול לגרום לביטוי Ascl1 בתרבית MG21. ביטוי Ascl1 בתאים חיים הודגם באמצעות עכבר כתב Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). עכבר עיתונאי הוא עכבר מהונדס גנטית שיש לו גן עיתונאי המוחדר לדנ”א שלו. גן מדווח זה מקודד לחלבון עיתונאי, שנמצא במחקר זה tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום. חלבון כתב זה מדווח על ביטוי של גן בעל עניין, במקרה זה, Ascl1. במילים אחרות, תאים המבטאים Ascl1 יהפכו לאדומים. מכיוון ש– Ascl1 מתבטא רק ב- RPCs9, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl זה מאפשר מעקב אחר המרת MG ל- Ascl1 המבטאת RPCs, כלומר המרת תאים תבטא חלבון כתב tdTomato פלואורסצנטי אדום. זהו תיוג בלתי הפיך מכיוון שהדנ”א של תאים אלה משתנה. כתוצאה מכך, כל התמיינות עצבית עוקבת תודגם מכיוון שהתווית tdTomato נשארת בתאים מתמיינים. אם Ascl1 מבטא RPCs שמקורם ב-MG (עם תווית tdTomato) מתמיינים לנוירונים, נוירונים אלה עדיין יהיו בעלי התווית האדומה שלהם. עכבר זה, אם כן, מאפשר לא רק תיוג של RPCs שמקורם ב-MG להדמיית תאים חיים, אלא גם מאפשר מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של RPCs אלה שמקורם ב-MG (אדום). לאחרונה זוהתה קבוצת miRNA ב-RPCs ותרביות MG של Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter עכברים שימשו לסינון ובדיקת ההשפעה של miRNA אלה על יכולת התכנות מחדש והיעילות27. מועמד אחד, ה-RPC-miRNA miR-25, נמצא מסוגל לתכנת מחדש את MG בתרבית לתאים המבטאים Ascl1 (Ascl1-Tomato+). תאים מתוכנתים מחדש אלה מאמצים תכונות עצביות לאורך זמן, כולל מורפולוגיה עצבית (סומטה קטנה ותהליכים עדינים קצרים או ארוכים), ביטוי של תעתיקים עצביים הנמדדים באמצעות scRNA-Seq, כמו גם ביטוי של חלבונים עצביים המאומתים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי27.

כאן, הפרוטוקול מפרט כיצד לגדל ולהחליף MG מעכברי P12 שהותאמו מהעבודה הקודמת 21,24,27. נבחר לפרוטוקול זה הוא miRNA miR-25 הנ”ל, miRNA המבוטא מאוד ב-RPCs, עם רמות ביטוי נמוכות ב-MG או בתאי עצב ברשתית. על מנת לבטא יתר על המידה miR-25, מורין miR-25 מחקה, כלומר, מולקולות miRNA מלאכותיות משמשות. כבקרה, נבחרים חיקויים של miRNA מ– Caenorhabditis elegans, שאין להם שום תפקיד בתאי יונקים. ההדמיה של ההמרה של MG ל-RPCs נעשתה באמצעות עכבר הכתב RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), עכבר עם רקע מעורב (זני C57BL/6, S129 ו-ICR). עם זאת, תרבות זו יכולה להתבצע עם כל זני העכברים, כולל זנים מסוג בר. בשנים האחרונות, הפרוטוקול המקורי שונה כדי לקצר את משך שלב הגדילה ואת תקופת התרבית הכוללת ולהבטיח מצב חזק יותר של תאי גליה ולמזער את מידת הניוון התאי, המתרחשת בתקופות תרבית ממושכות. חלון הזמן הרגיל של הטרנספקציה הוארך גם הוא מ-3 שעות ליומיים. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתאר תרביות MG ככלי למחקרי התחדשות, השיטה לא רק שימושית לבדיקת גורמי תכנות מחדש, אלא יכולה להיות מותאמת גם ליישומים אחרים, כולל מחקרים על התנהגות נודדת או התפשטות של MG, פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים, ו/או זיהוי מנגנונים ומסלולים בסיסיים.

Protocol

נהלים הנוגעים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת SUNY לאופטומטריה. הערה: פרוטוקול תרבות זה מורכב משלושה שלבים: גדילה, טרנספקציה ושלב המרה. סיכום של הפרוטוקול הכולל עם ציר הזמן ניתן באיור 1. 1. הכ…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר P12 וכיצד לתכנת מחדש את התאים האלה עם miR-25 לנוירונים ברשתית באמצעות עכבר הכתב Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. שיטה זו שימשה בעבודה קודמת המדווחת בפירוט על miRNAs מתאימים אחרים (מחקים או מעכבים, כמולקולות בודדות או בשילוב) כדי לתכנת מחדש את MG ל-RPC שמאמ…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר מנותקות לצורך תכנות מחדש של מחקרים באמצעות miRNAs. כפי שהוכח ואושר במגוון מחקרים קודמים, הרוב המכריע (80%-90%) של התאים שנמצאו בתרביות אלה הם MG 20,23,24. שיטה זו היא טכניקה חזקה ואמינה מאוד וניתן לשחזר בקלות ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר אן ביטון ולכל חברי המעבדה על התייחסותם לכתב היד. תודה מיוחדת לד”ר טום רה, ג’וליה פולק וראס טיילור על הצגת התרבויות הראשוניות של MG ככלי סינון ל- S.G.W. במהלך הכשרת פוסט-דוקטורט באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. המחקר מומן על ידי מענק תוכנית החדשנות של האימפריה (EIP) ל- S.G.W. וקרנות סטארט-אפ מ- SUNY אופטומטריה ל- S.G.W., כמו גם פרס R01EY032532 ממכון העיניים הלאומי (NEI) ל- S.G.W.

Materials

Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax laboratories #012882 Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Jax laboratories #007914 Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer Sigma-Aldrich H7904-5MG reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution VWR 100504-782 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-546-152 dilution 1:500
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 705-606-147 dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems Fisher Scientific AF1979 dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody Sigma-Aldrich M9942-200UL dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody Antibodies-Online ABIN334653 dilution 1:500
Ascorbic Acid STEMCELL Technologies 72132 reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044 frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher Scientific C10340 reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP STEMCELL Technologies 73886 reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35010CV frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Fisher Scientific 51-985-034 store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Fisher Scientific 12-605-028 used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS Fisher Scientific 14-025-134 store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural Fisher Scientific 23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-Glutamine Fisher Scientific 25-030-081 frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control Horizon CN-001000-01-50 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic Horizon C-310564-05-0050 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement Fisher Scientific 17-502-048 frozen aliquots
Neurobasal Medium Fisher Scientific 21-103-049 used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK003153 reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific 20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P4538-50MG reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein R&D Systems 248-BDB-050/CF reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein Fisher Scientific 2028EG200 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein Fisher Scientific 512GF010 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-296-150 dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) Fisher Scientific L3000015 store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) Eppendorf 2231300008
Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 Fisher Scientific 08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 Fisher Scientific 08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves Fisher Scientific 19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) Fisher Scientific 22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm Fisher Scientific 09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet Thermo Scientific 1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 Keyence 9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope Vision Scientific VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) VWR 25384-088
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium Fine Science Tools 11252-40
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium Fine Science Tools 11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R Eppendorf 2231000508
Fine Scissors-sharp Fine Science Tools 14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm World Precision Instruments 14124
Metal bead bath Lab Armor 74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm VWR 82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) Living Systems Instrumentation DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5 World Precision Instruments 501979
Water Jacketed CO2 Incubator VWR 10810-744

References

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Play Video

Cite This Article
Kang, S., Wohl, S. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (181), e63651, doi:10.3791/63651 (2022).

View Video