MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri
Summary
Fare retinalarından elde edilen Müller glia primer kültürleri, mikroRNA tedavisinden sonra retinal progenitör hücrelere glial dönüşümü incelemek için çok sağlam ve güvenilir bir araçtır. Tek moleküller veya kombinasyonlar, daha sonra in vivo yaklaşımların uygulanmasından önce test edilebilir.
Abstract
Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glia’dır ve retinal nöronlar için rejeneratif bir kaynak olarak işlev görebilir. Balıklar gibi alt omurgalılarda, MG güdümlü rejenerasyon doğal olarak gerçekleşir; Bununla birlikte, memelilerde, belirli faktörlerle stimülasyon veya genetik / epigenetik manipülasyon gereklidir. MG, retinal hücre popülasyonunun sadece% 5’ini oluşturduğundan, yalnızca bu hücre popülasyonunun incelenmesine izin veren model sistemlere ihtiyaç vardır. Bu model sistemlerden biri, tekrarlanabilir ve molekül / faktör taraması ve tanımlama, bileşiklerin veya faktörlerin test edilmesi, hücre izleme ve / veya fonksiyonel testler dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilen birincil MG kültürleridir. Bu model, yapay miRNA’ların veya inhibitörlerinin transfeksiyonu yoluyla mikroRNA’ların (miRNA’lar) takviyesi veya inhibisyonundan sonra murin MG’nin retinal nöronlara dönüşme potansiyelini incelemek için kullanılır. MG’ye özgü muhabir farelerin immünofloresan etiketleme ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) ile birlikte kullanılması, bu kültürlerde bulunan hücrelerin% 80-90’ının MG olduğunu doğruladı. Bu modeli kullanarak, miRNA’ların MG’yi retinal progenitör hücrelere (RPC’ler) yeniden programlayabildiği keşfedildi. Bu tekniğin avantajları, miRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir.
Introduction
Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glialardır. Merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerindeki diğer glia’lara kıyasla, su ve iyon homeostazını korumak, nöronları beslemek ve dokuyu korumak gibi benzer işlevlere sahiptirler. MG’nin başka bir büyüleyici özelliği daha vardır: olgun glia olmalarına rağmen, geç gelişim sırasında retinal progenitör hücrelerde (RPC’ler) eksprese edilen birçok geni hala eksprese ederler 1,2. Bu benzerliğin, retina hasarından sonra balık retinasında doğal olarak oluşan MG bazlı nöronal rejenerasyonun nedeni olduğu varsayılmaktadır 3,4. Bu işlem sırasında, MG hücre döngüsüne tekrar girer ve daha sonra altı tip retinal nöronun hepsine farklılaşan RPC’lere farklılaşır. Bu fenomen balıklarda doğal olarak meydana gelmesine rağmen, memeli MG nöronlara dönüşmez 5,6. Bununla birlikte, yeniden programlanabilirler. MG’yi RPC’lere / nöronlara yeniden programlayan çeşitli faktörler gösterilmiştir; Bu faktörler arasında balık rejenerasyonunda rol oynayan temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü achaete-scute homolog 1 (Ascl1) 7,8’dir. Farelerde, Ascl1 sadece retinogenez sırasında RPC’lerde eksprese edilir, ancak olgun MG veya retinal nöronlardayoktur 9.
Hücrelerin doğrudan in vivo olarak yeniden programlanması sadece metodolojik olarak zor değil, aynı zamanda kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayını gerektirir. Onay almak için, kullanılan veya değiştirilen faktör(ler), konsantrasyonlar, hedef dışı etkiler, altta yatan mekanizmalar, toksisite ve verimlilik hakkında ön veriler gereklidir. Hücre kültürü sistemleri, in vivo modellerde kullanılmadan önce bu kriterlerin test edilmesine izin verir. Dahası, MG tüm retinal hücre popülasyonunun sadece% 5’ini oluşturduğundan 10, MG kültürleri fonksiyonlarının 11’inin yanı sıra göç 12,13, proliferasyon 14, yaralanma / hasara stres reaksiyonu15,16, mikroglia 17 veya retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) gibi diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere davranışlarının incelenmesine izin verir. veya nörojenik potansiyelleri 19,20,21. Birçok araştırmacı, sınırsız bir proliferatif potansiyele sahip oldukları ve kolayca korunabildikleri ve transfekte edilebildikleri için çalışmaları için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanır. Bununla birlikte, birincil hücreler, biyolojik olarak ilgili analizler için ölümsüzleştirilmiş hücrelerden daha tercih edilir, çünkü gerçek hücre özelliklerine (gen ve protein ekspresyonu) sahiptirler ve daha da önemlisi, gelişimde belirli bir aşamayı temsil ederler ve bu nedenle bir “yaş” vardır. Bir hayvanın yaşı (ve dolayısıyla bir hayvandan elde edilen hücrelerin), hücresel yeniden programlamada özellikle önemli bir faktördür, çünkü hücre plastisitesi, gelişimin ilerleme aşamasıyla azalır22.
Bu protokol, primer MG’nin miRNA’larla rejenerasyonu incelemek için akım in vitro bir yöntem olarak nasıl yeniden programlanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu MG birincil kültür modeli, P53 nakavt farelerde (trp53-/- fareler)23 MG’nin hücre proliferasyon özelliklerini değerlendirmek için 2012 yılında kurulmuştur. Kültürlenmiş MG’nin glial özelliklerini koruduğu (yani, immünofloresan etiketleme yoluyla değerlendirilen S100β, Pax6 ve Sox2 proteinlerinin ekspresyonu) ve in vivo MG’ye (FACS-saflaştırılmış MG’nin mikrodizisi) benzedikleri gösterilmiştir23. Kısa bir süre sonra, glial mRNA ve protein ekspresyonu, viral vektörler20 kullanılarak farklı bir yaklaşımla doğrulandı ve doğrulandı. Birkaç yıl sonra, MG’ye özgü Rlbp1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl muhabir faresi24 kullanılarak bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğunun MG olduğu doğrulandı. Dahası, hem FACS-saflaştırılmış MG hem de kültürlenmiş primer MG’deki miRNA setinin nicelleştirilmesi, MG miRNA’larının (mGLiomiR’ler) seviyelerinin, büyüme aşamasında kültürlenmiş MG’de çok fazla değişmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, uzamış kültür dönemleri, miRNA’lar translasyonel düzenleyiciler olduğu için miRNA seviyelerinde ve dolayısıyla mRNA seviyelerinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olur25.
2013 yılında, bu MG kültür modeli, MG’yi retinal nöronlara yeniden programlama yeteneklerine göre çeşitli transkripsiyon faktörlerini test etmek için kullanılmıştır20. Ascl1’in çok sağlam ve güvenilir bir yeniden programlama faktörü olduğu bulunmuştur. Ascl1’in viral vektörler yoluyla aşırı ekspresyonu, morfolojik değişikliklere, nöronal belirteçlerin ekspresyonuna ve nöronal elektrofizyolojik özelliklerin kazanılmasına neden olmuştur. Daha da önemlisi, bu ilk in vitro deneylerden elde edilen içgörüler ve sonuçlar, primer MG kültürlerinin in vivo uygulamadan önce ilk faktör taramaları ve glial özelliklerin değerlendirilmesi için sağlam ve güvenilir bir araç olduğunu gösteren 22,26 in vivo uygulamalara başarıyla aktarılmıştır.
Birkaç yıl önce, retinal nöronlarda da yüksek oranda eksprese edilen beyinle zenginleştirilmiş miRNA miR-124’ün, kültürlü MG21’de Ascl1 ekspresyonunu indükleyebileceği gösterilmiştir. Canlı hücrelerdeki Ascl1 ekspresyonu, bir Ascl1 muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl) aracılığıyla görselleştirildi. Bir muhabir faresi, DNA’sına yerleştirilmiş bir muhabir genine sahip genetik olarak tasarlanmış bir faredir. Bu muhabir geni, bu çalışmada kırmızı bir floresan proteini olan tdTomato’da bulunan bir muhabir proteinini kodlar. Bu muhabir proteini, ilgilenilen bir genin, bu durumda, Ascl1’in ekspresyonunu bildirir. Başka bir deyişle, Ascl1’i eksprese eden hücreler kırmızıya döner. Ascl1 yalnızca RPC9’da ifade edildiğinden, bu Ascl1 CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl faresi, MG dönüşümünün RPC’leri ifade eden Ascl1’e dönüştürülmesinin izlenmesine izin verir, yani dönüştürücü hücreler kırmızı floresan tdDomates raporlayıcı proteinini ifade edecektir. Bu, bu hücrelerin DNA’sı değiştirildiği için geri dönüşümsüz bir etiketlemedir. Sonuç olarak, sonraki herhangi bir nöronal farklılaşma görselleştirilecektir, çünkü tdDomates etiketi farklılaşan hücrelerde kalır. MG kaynaklı RPC’leri (tdDomates etiketli) ifade eden Ascl1 nöronlara farklılaşırsa, bu nöronlar hala kırmızı etiketlerine sahip olacaktır. Bu nedenle, bu fare, yalnızca MG türevli RPC’lerin canlı hücre görüntüleme için etiketlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bu MG türevi (kırmızı) RPC’lerin kader haritalamasına ve soy izlemesine de izin verir. Daha yakın zamanlarda, RPC’lerdeki miRNA seti tanımlandı ve bu miRNA’ların yeniden programlama kapasitesi ve verimliliği üzerindeki etkisini taramak ve test etmek için Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter farelerin MG kültürleri kullanıldı27. Bir aday, RPC-miRNA miR-25, kültürlenmiş MG’yi Ascl1 eksprese eden (Ascl1-Domates +) hücrelere yeniden programlayabildiği bulundu. Bu yeniden programlanmış hücreler, nöronal morfoloji (küçük somata ve kısa veya uzun ince süreçler), scRNA-Seq ile ölçülen nöronal transkriptlerin ekspresyonu ve immünofloresan etiketleme27 ile doğrulanan nöronal proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere zamanla nöronal özellikleri benimser.
Burada, protokol, önceki çalışma21,24,27’den uyarlanmış P12 farelerinden MG’nin nasıl yetiştirileceğini ve transfekte edileceğini detaylandırıyor. Bu protokol için seçilen, yukarıda belirtilen miRNA miR-25, RPC’lerde yüksek oranda eksprese edilen, MG veya retinal nöronlarda düşük ekspresyon seviyelerine sahip bir miRNA’dır. MiR-25’i aşırı eksprese etmek için murin miR-25 taklitleri, yani yapay miRNA molekülleri kullanılır. Kontrol olarak, Caenorhabditis elegans’tan bir miRNA’nın taklitleri, memeli hücrelerinde hiçbir işlevi olmayan seçilir. MG’nin RPC’lere dönüşümünün görselleştirilmesi, RPC muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl), karışık arka plana sahip bir fare (C57BL/6, S129 ve ICR suşları) ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu kültür, vahşi tip suşlar da dahil olmak üzere tüm fare suşlarıyla gerçekleştirilebilir. Son birkaç yılda, orijinal protokol, büyüme fazı süresini ve genel kültür dönemini azaltmak ve daha sağlam bir glia hücresi durumu sağlamak ve uzun kültür dönemlerinde meydana gelen hücresel dejenerasyon derecesini en aza indirmek için değiştirilmiştir. Düzenli transfeksiyon süresi de 3 saatten 2 güne uzatıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut protokol MG kültürlerini rejenerasyon çalışmaları için bir araç olarak tanımlasa da, yöntem sadece yeniden programlama faktörlerini test etmek için yararlı değildir, aynı zamanda MG göçü veya proliferatif davranışı, yaralanma / hücre hasarı ile ilgili paradigmalar ve / veya altta yatan mekanizmaların ve yolların tanımlanması ile ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere diğer uygulamalar için de uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, miRNA’ları kullanarak yeniden programlama çalışmaları için ayrışmış fare retinalarından MG’nin nasıl yetiştirileceğini açıklar. Önceki çeşitli çalışmalarda gösterildiği ve doğrulandığı gibi, bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu (% 80-90) MG 20,23,24’tür. Bu yöntem çok sağlam ve güvenilir bir tekniktir ve protokol doğru takip edilirse sonuçlar kolayca çoğaltı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dr. Ann Beaton’a ve tüm laboratuvar üyelerine makaleye katkıları için teşekkür eder. Seattle’daki Washington Üniversitesi’nde doktora sonrası eğitim sırasında MG birincil kültürlerini S.G.W.’ye bir tarama aracı olarak tanıttıkları için Dr. Tom Reh, Julia Pollak ve Russ Taylor’a özel teşekkürler. Çalışma, S.G.W.’ye Empire İnovasyon Programı (EIP) Hibesi ve SUNY Optometri’den S.G.W.’ye başlangıç fonlarının yanı sıra Ulusal Göz Enstitüsü’nden (NEI) S.G.W.’ye R01EY032532 ödülü ile finanse edildi.
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
