Методическая статья

Обнаружение штамма Wolbachia wAlbB в клеточных линиях Aedes albopictus

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63662

⸱

1 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Для выявления внутриклеточной вольбахии использовались четыре метода, которые дополняли друг друга и повышали точность обнаружения инфекции Wolbachia Aedes albopictus Aa23 и Aa23-T, вылеченной от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков.

Аннотация

Как материнский эндосимбионт, Wolbachia заражает большую часть популяций насекомых. Недавно в исследованиях сообщалось об успешной регуляции передачи РНК-вируса с использованием комаров, транс инфицированных Wolbachia. Ключевые стратегии борьбы с вирусами включают манипулирование размножением хозяина через цитоплазматическую несовместимость и ингибирование вирусных транскриптов посредством иммунного прайминга и конкуренции за ресурсы, полученные от хозяина. Однако основные механизмы реакций комаров, транс инфицированных Вольбахией, на вирусную инфекцию плохо изучены. В этой статье представлен протокол идентификации in vitro инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка в клетках Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 для улучшения понимания взаимодействий между Wolbachia и ее насекомыми-переносчиками. Благодаря комбинированному использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР, западного блоттинга и иммунологических аналитических методов был описан стандартный морфологический протокол для обнаружения клеток, инфицированных Вольбахией, который является более точным, чем использование одного метода. Этот подход также может быть применен к обнаружению инфекции Wolbachia у других таксонов насекомых.

Введение

Азиатский тигровый комар Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), который является ключевым переносчиком вируса денге (DENV) в Азии и других частях мира1, является естественным хозяином двух типов внутриклеточных бактерий, Wolbachia (wAlbA и wAlbB), которые распределены по всей зародышевой линии и соматической ткани 2,3. Клеточная линия Aa23, полученная из эмбрионов A. albopictus, состоит, по меньшей мере, из двух морфологических типов клеток, оба из которых поддерживают инфекцию4 и могут быть излечены от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков (Aa23-T). Учитывая, что Aa23 сохраняет только wAlbB, это полезная модель для изучения взаимодействий хозяин-эндосимбионт 4,5,6.

Wolbachia передается через мать и заражает, по оценкам, 65% видов насекомых 8,9 и 28% видов комаров10. Он инфицирует различные ткани и формирует интимные симбиотические отношения с хозяином, обычно вызывая цитоплазматическую несовместимость (CI)11 и популяционную замену путем манипулирования репродуктивной системой хозяина12,13. Эти ответы хозяина наблюдались в естественных популяциях Drosophila simulans14 и у A. aegypti в лабораторной клетке и полевых испытаниях15. Важной нерепродуктивной манипуляцией, вызванной Вольбахией, является индуцированная устойчивость хозяина к различным патогенам, включая DENV, вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус Западного Нила (ВЗН)16,17, которые могут быть опосредованы улучшенной врожденной иммунной системой симбионта18,19, конкуренцией между Wolbachia и вирусами за основные ресурсы хозяина20 и манипулированием путями вирусной защиты хозяина21 .

Этот протокол был разработан для изучения этих основных механизмов противовирусных реакций хозяина, вызванных Вольбахией. В нем используются четыре метода выявления внутриклеточной вольбахской инфекции клеток Aa23. Эти методы обеспечивают прочную теоретическую основу для исследований внутриклеточной инфекции Wolbachia других видов хозяев. Первый метод, ПЦР - мощный метод, позволяющий ферментативную амплификацию определенных областей ДНК без использования обычных процедур клонирования - был использован для обнаружения ДНК Wolbachia и определения наличия /отсутствия инфекции Wolbachia 22. Второй метод измеряет плотность копий ДНК Wolbachia с использованием количественной ПЦР (qPCR) для надежного обнаружения и измерения продуктов, генерируемых во время каждого цикла ПЦР, что прямо пропорционально количеству шаблона до ПЦР23. Третий метод обнаруживает наличие внутриклеточных белков Wolbachia , используя западный блот — один из самых мощных инструментов для обнаружения специфических белков в сложных смесях путем сочетания высокой силы разделения электрофореза, специфичности антител и чувствительности хромогенных ферментативных реакций. Окончательным методом является иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который сочетает иммунологию, биохимию и микроскопию для обнаружения поверхностного белка Wolbachia (wsp) через реакцию антиген-антитело для подтверждения клеточного поглощения Wolbachia и определения его клеточной локализации.

В этой статье описываются четыре метода, перечисленные выше для проверки существования Wolbachia в клетках, которые могут быть использованы для определения того, была ли экзогенная Wolbachia успешно трансфектирована и Wolbachia в клетке была очищена. После определения того, присутствует ли Вольбахия в клетках или нет, может быть выполнено множество различных анализов, включая геномику, протеомику или метаболомику. Этот протокол демонстрирует обнаружение Wolbachia через клетки Aa23, но также может быть использован в других клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Материалы и реагенты

  1. Используйте безпирогеновые растворы и среды для клеточной культуры (см. Таблицу материалов).
  2. Используйте сверхчистую воду для приготовления всех растворов.
  3. Будьте осторожны при выборе фетальной бычьей сыворотки (FBS) для клеточной культуры после процесса проверки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лоты FBS могут регулярно изменяться, в этом протоколе невозможно указать соответствующий каталог и номера партий.
  4. Выберите штаммы клеток Aa23, полученные из яиц A. albopictus , соответствующие Aa23-T без Wolbachia.

2. Клеточная культура

  1. Приготовьте колбы с культурой25 см2 с 4 мл среды Шнайдера с 10% FBS.
  2. Инкубируют колбы при 28 °C при 5% CO2 атмосферы в течение 5-7 дней 7,24.
  3. Наблюдайте незапятнанные Aa23 и Aa23-T-клетки в колбах с помощью световой микроскопии при 100-кратном увеличении (рисунок 1).

3. Извлечение ДНК

  1. Культивируйте клетки в течение 5-7 дней до 70-80% слияния на колбу (шаг 2). Собирают клетки с ручным пипетированием из 1 мл повторно суспендированной питательной среды методом центрифугирования в течение 5 мин при 100 × г в микроцентрифуге.
  2. Удалите супернатант путем аспирации и храните полученную ячейку гранулы при -20 °C.
  3. Повторно суспендировать гранулы в 0,40 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), поместить 50 мкл раствора в микроцентрифужную пробирку, добавить 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч. Наконец, нагревайте эти трубки при 99 °C в течение 15 мин, чтобы получить сырую ДНК и сохранить ее при -20 °C.

4. Обнаружение нуклеиновой кислоты Wolbachia

  1. ПЦР-анализ
    1. Выполняют ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, содержащем 8 мкл ddH2O, 10 мкл taq-полимеразы (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (из стадии 3), 0,5 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') и wsp691R (5' AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, соответственно.
    2. Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 35 циклов денатурации при 94 °C, отжиг при 55 °C и удлинение при 72 °C; затем окончательное расширение при 72 °C в течение 7 мин.
    3. Обнаружение ДНК на 1% агарозном геле (1% мас./об.агарозы в PBS) с помощью гелевого тепловизора.
  2. Анализ qPCR
    1. Проанализируйте копию генома Wolbachia на три биологические реплики (n = 6) из извлеченной ДНК (этап 3) с использованием праймеров wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') и QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, нормализованных рибосомальным белком S6 (RPS6) прямыми и обратными праймерами (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' и 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', соответственно)3.
    2. Создайте стандартную кривую для wAlbB и RPS6.
      1. Извлечение ДНК из PMD-18T (специальный вектор для эффективного клонирования продуктов ПЦР (TA клонирование)) рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагменты генов wsp и rps6 (Дополнительный файл) и измерение концентрации плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов).
      2. Преобразуйте концентрацию плазмидной ДНК в концентрацию числа копий с помощью Eq (1).
        Номер копии плазмиды = figure-protocol-1 (1)
      3. Разбавляют число плазмидных копий от 101 до 108 сверхчистой водой, и устанавливают 3 реплики для каждого градиента концентрации.
      4. Выполните амплификацию qPCR с использованием TB Green и системы ПЦР в режиме реального времени (см. Таблицу материалов) и запишите результаты каждой реакции. Используйте значение Ct для разработки стандартной кривой. Проанализируйте ДНК в общем реакционном объеме 20 мкл, включающем 7 мкл ddH2O, 10,4 мкл TB Green (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (предусмотренного этапом 3) и 0,8 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ). Используйте следующие условия реакции: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с и отжиг при 60 °C в течение 35 с.
      5. Рассчитайте количество копий генов WSP и RPS6 в клетках в соответствии с установленной стандартной кривой и относительной плотностью Wolbachia по числу копий wsp/RPS6. Анализируйте данные с помощью независимых образцов t-теста.
  3. Вестерн-блот-анализ белка Wolbachia
    1. Экстракция белка
      1. Соберите 2 × 107 Aa23 и Aa23-T-клеток из шестилуночной пластины (из стадии 2) в микроцентрифужной трубке, промыть их три раза PBS и центрифугировать их при 100 × г в течение 5 мин при 4 °C.
      2. Готовят 1 мл лизатов с буфером лизиса RIPA (50 мМ Tris (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия [SDS], 2 мМ пирофосфата натрия, 25 мМ β-глицерофосфата, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3VO4, 0,5 мкг/мл лейпептина) и PMSF (конечная концентрация 1 мМ).
      3. Добавьте 200 мкл буфера лизиса в гранулу клетки и выдерживайте в течение 30 минут на льду. Центрифугируют лизаты при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант.
    2. Анализ концентрации супернатанта wsp с использованием набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Нагрузите равное количество белка на 15% гель SDS-PAGE [10% дистиллированной воды; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% персульфата аммония), 0,04% TEMED].
    4. Перенесите белок на нитроцеллюлозные мембраны, блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение 2 ч 26,27 при комнатной температуре, а затем трижды промывайте мембраны TBST (1 мл Tween 20 в 1 л TBS) (см. Таблицу материалов).
    5. Инкубировать мембраны в течение ночи при 4 °C со 100 мкл поликлонального антитела против wsp (приготовленного собственными силами, см. Дополнительный файл)), приготовленного путем разбавления первичного антитела 5% обезжиренным молоком (1:12 000).
    6. Промыть первичное антитело три раза с помощью TBST.
    7. Инкубируют мембраны в 100 мкл пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированного вторичного антитела на шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре.
    8. Промыть мембраны три раза TBST и смешать 20 мкл раствора A (HRP Substrate Luminol Regent) и 20 мкл раствора B (HRP Substrate Peroxide Reagent) в наборе для детектирования хемилюминесценции в соотношении 1:1. Одновременно погрузите всю мембрану в люминесцентный раствор и наблюдайте за сигналами с помощью многофункциональной системы визуализации.
  4. Иммунофлуоресцентная локализация белка Wolbachia
    1. Инкубировать 5 × 105 Aa23 и Aa23-T-клеток при 28 °C на лазерной конфокальной чашке Петри толщиной 0,17 мм на дне, под 5% атмосферой CO2 в течение 3 - 4 дней 7,24. Подождите, пока клетка не сольется на 60%-70% и трижды промыть клетки PBS.
    2. Фиксируйте клетки в течение 20 мин при 4 °C в 1 мл 4% (мас./об.) параформальдегида в PBS.
    3. Промывайте фиксированные ячейки с помощью PBST (0,2% v/v Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и дважды промывайте ячейки PBS.
    4. Инкубировать слайды в течение 1 ч при 37 °C в 1 мл 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS.
    5. Инкубируйте слайды в течение ночи в 100 мкл мышиного анти-wsp поликлонального антитела (приготовленного собственными силами) и мышиной сыворотки (1:1000 разведения в PBS) во влажном ящике (он может поддерживать влажность и предотвращать испарение влаги) при 4 °C.
    6. Извлеките слайды из мокрого ящика и верните их к комнатной температуре; вымойте их три раза с PBS и удалите PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этапа 4.4.7 и далее, все операции должны быть защищены от света.
    7. Инкубируйте слайды со 100 мкл конъюгированного козьего антимышьего антитела Alexa Fluor 488 (разведение 1:2000 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
    8. Инкубируют образцы слайдами с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI разводят в PBS до 10 мкг/мл, прочно связываются с ДНК) при 37 °C в течение 5 мин, а затем промывают их три раза PBS.
    9. Наблюдайте за иммуноокрашиванием под конфокальным микроскопом.
      1. Включите питание и лазер.
      2. Включите обычную и ртутную лампы микроскопа.
      3. Запустите систему и запустите операционное программное обеспечение. Поместите каплю кедрового масла на слайды образца, поместите слайды образца на ступень микроскопа и переместите сцену в соответствующее положение.
      4. Нажмите кнопку наблюдения ртутной лампы в программном обеспечении, откройте затвор ртутной лампы и наблюдайте за образцом под перевернутым микроскопом для фокусировки.
      5. Используйте ручную панель управления для выбора зеленой и синей флуоресценции для получения флуоресцентных фотографий при 100-кратном увеличении.
      6. Выключите кнопку наблюдения ртутной лампы и начните получать изображения.
      7. Чтобы обеспечить хорошее качество изображения, выполните предварительное сканирование по размеру сканирования (512 пикселей x 512 пикселей). Отрегулируйте размер сканирования для получения четких изображений (1 024 x 1 024 пикселя).
      8. Выполните шумоподавление, если фоновый шум слишком высок.
      9. Остановите сканирование и сохраните изображения.
      10. Выключите ртутную лампу и лазеры.
      11. Протрите объектив 75% спиртом и опустите объектив в самое низкое положение.
      12. Выключите затвор и питание микроскопа.
      13. После того, как инструмент остынет, накройте его пылезащитным чехлом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

До того, как Wolbachia была обнаружена, клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом, чтобы определить любые морфологические различия между двумя клеточными линиями. Aa23 и Aa23-Т-клетки имеют, по крайней мере, две морфологии клеток, но нет очевидной морфологической разницы между двумя типами клеток (рисунок 1).. Здесь клетки Aa23 были использованы в качестве модельной системы для обнаружения инфекции Wolbachia с использованием четырех методов....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обнаружение внутриклеточной инфекции Wolbachia имеет важное значение для изучения взаимодействий Wolbachia-host и подтверждения успешной трансфекции клеток с новыми штаммами. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белков. Эти четыре экспериментальных метода подтвердили и улучшили точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках.

ПЦР была использована для вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Синь-Ру Вана из Университета Миннесоты за проницательные предложения и рекомендации. Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 81760374).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
МикроскопZeissSteREO Discovery V8
Чашка ПетриFisher ScietificFB0875713
ПипеткаПипетманаF167380P10
inSituX платформа
Analysis программное обеспечениеСобственная разработка
Cerium легированный иттрий-алюминий-гранатMSE SuppliesCe:Y3Al5O12, монокристаллические подложки YAG
Держатель чипаПрограммное обеспечение для
Иммерсионное маслособственной
на платформе SituXИнфракрасный источник света собственной разработки
Thorlabs IncorporatedLED1085Lсветодиод со стеклянной линзой, 1085 нм, 5 мВт, внешнее кольцо TO-18
 Лазеры
 Thorlabs IncorporatedLD785-SE400785 нм, 400 мВт, и Oslash; 9 мм, E Pin Code, лазерный диод
Raspberry PiRaspberry Pi Fundation
Стопорное кольцоThorlabs IncorporatedSM1RRSM1 стопорное кольцо для & Oslash; 1-дюймовые линзовые трубки и крепления
из кварцевых кристаллов без затравокUniversity Wafers, Inc.U01-W2-L-190514Диаметр Z-образный срез 25,4 мм Толщина 0,05 мм двусторонняя полировка 8 мм на -X
ПрокладкаОграничитель
Собственная разработка
управления собственной разработки разработки Cargille Laboratories 16482 Тип А низкая вязкость 150 сСт  накачки собственной разработки рентгеновского луча собственной разработки

Ссылки

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

WolbachiaAedes albopictusWolbachia

Похожие статьи