네 가지 방법이 세포 내 Wolbachia를 검출하기 위해 사용되었는데, 이는 서로를 보완하고 항생제를 사용하여 네이티브 울바키아 감염의 Aa23 및 Aa23-T가 완치된 Aedes albopictus 유래 Aa23 및 Aa23-T의 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 향상시켰다.
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방법 논문
Aedes albopictus 세포주에서 Wolbachia 균주 wAlbB 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
모성으로 품어진 내생 생물로서 Wolbachia는 곤충 개체군의 많은 부분을 감염시킵니다. 최근 연구에 따르면 울바키아 형질감염된 모기를 이용한 RNA 바이러스 전염의 성공적인 조절이 보고되었다. 바이러스를 조절하기 위한 주요 전략은 세포질 비양립성을 통한 숙주 재생의 조작과 숙주 유래 자원에 대한 면역 프라이밍 및 경쟁을 통한 바이러스 전사체의 억제를 포함한다. 그러나 바이러스 감염에 대한 Wolbachia-transfected 모기의 반응의 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 이 논문은 울바키아와 그의 곤충 벡터 사이의 상호작용에 대한 이해를 향상시키기 위해 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 세포에서 핵산 및 단백질 수준에서 울바키아 감염의 시험관내 확인을 위한 프로토콜을 제시 한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR, 웨스턴 블롯 및 면역학적 분석 방법의 조합된 사용을 통해, 단일 방법의 사용보다 더 정확한 울바치아 감염 세포의 검출을 위한 표준 형태학적 프로토콜이 기술되었다. 이 접근법은 또한 다른 곤충 탁사에서 울바키아 감염의 검출에 적용될 수 있다.
서론
아시아 호랑이 모기 Aedes albopictus (Skuse) (Diptera : Culicidae)는 아시아 및 세계1의 다른 지역에서 뎅기열 바이러스 (DENV)의 핵심 벡터이며, 생식선과 체세포 조직 2,3에 걸쳐 분포하는 두 가지 유형의 세포 내 박테리아 인 Wolbachia (wAlbA 및 wAlbB)의 자연 숙주입니다. A. 알보픽투스 배아로부터 유래된 Aa23 세포주는 적어도 두 가지 형태학적 세포 유형으로 구성되며, 둘 다 감염4를 지지하고 항생제(Aa23-T)를 사용하여 천연 울바키아 감염을 치료할 수 있다. Aa23이 단지 wAlbB만을 보유한다는 것을 감안할 때, 숙주-endosymbiont 상호작용 4,5,6의 연구에 유용한 모델이다.
울바키아
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프로토콜
1. 재료 및 시약
- 세포 배양을 위해 발열원이없는 용액과 배지를 사용하십시오 ( 재료 표 참조).
- 초순수를 사용하여 모든 용액을 준비하십시오.
- 세포 배양을 위해 태아 소 혈청 (FBS)을 선택할 때 조심하십시오, 로트 확인 과정을 따르십시오.
참고: FBS 로트는 정기적으로 변경될 수 있으므로 이 프로토콜에서 관련 카탈로그 및 로트 번호를 명시하는 것은 불가능합니다. - 울바키아 프리 Aa23-T에 해당하는 A. 알보픽투스 알로부터 유래된 Aa23 세포 균주를 선택하십시오.
2. 세포 배양
- 슈나이더 배지4mL와 함께 25cm2 세포 배양 플라스크를 10% FBS로 준비합니다.
- 플라스크를 5% CO2 분위기 하에서28°C에서 5 내지 7일 동안 7,24일 동안 인큐베이션한다.
- 100x 배율에서 광 현미경을 사용하여 플라스크에서 염색되지 않은 Aa....
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결과
울바키아가 검출되기 전에, Aa23 및 Aa23-T 세포를 광학 현미경으로 관찰하여 두 세포주 사이의 형태학적 차이를 확인하였다. Aa23 및 Aa23-T 세포는 적어도 두 개의 세포 형태를 갖지만 두 세포 유형 사이에 명백한 형태학적 차이는 없다(도 1). 여기서, Aa23 세포는 네 가지 방법을 사용하여 울바키아 감염을 검출하기 위한 모델 시스템으로 사용되었다. 진단 프라이머 81F/691R을 사용한 Wolbachiawsp 유전자의 양성 증폭은 Aa23 세포(레인 1 및 2)에서는 가능했지만 Aa23-T 세포(레인 3 및 4)에서는 가능하지 않았다(도 2A). qPCR을 사용한 세포주에서 울바키아 밀도를 분석한 결과, Aa23 세포에서는 wsp/rps6 비율이 2.4였지만 Aa23.......
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토론
세포 내 울바키아 감염의 검출은 울바키아-숙주 상호작용의 연구와 새로운 균주를 가진 세포의 성공적인 형질감염의 확인에 필수적이다. 이 프로토콜에서는 핵산 및 단백질 수준에서 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 검출하기 위해 네 가지 방법이 사용되었습니다. 이 네 가지 실험 방법은 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선시켰다.
PCR은 핵산 수준에서 세포의 울바키아 감염의 존재를 검출하기 위해 사용되었다. 그러나, 감염 28,29의 수준을 정량화하지 않기 때문에, qPCR은 DNA 카피 밀도 28,30을 정량화하기 위해 사용되었다. PCR 방법의 정확성은 낮은 증폭 효율과 오탐에 의.......
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공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 통찰력있는 제안과지도에 대한 미네소타 대학의 Xin-Ru Wang 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81760374)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 현미경 | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| 페트리 접시 | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| 피펫 | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX 플랫폼 | |||
| 분석 소프트웨어 | 자체 개발 | ||
| Cerium doped 이트륨 알루미늄 가넷 | MSE는 | Ce:Y3Al5O12, YAG 단결정 기판을 | |
| 칩 홀더 | 자체 개발한 | ||
| 제어 소프트웨어입니다 | . | ||
| 수 오일 | Cargille Laboratories | 16482 | Type A 저점도 150 cSt |
| inSituX 플랫폼 | 자체 개발 | ||
| IR 광원 | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED와 유리 렌즈, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| 외부 링 | 자체 개발한 | ||
| 펌프 레이저 | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, E 핀 코드, 레이저 다이오드 |
| 라즈베리 파이 | 라즈베리 파이 펀테이션 | ||
| 보유 링 | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 보유 링 Ø 1" 렌즈 튜브 및 마운트 |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 직경 25.4 mm Z 컷 0.05 mm 두께 양면 연마 8mm 온 -X |
| 심 | 자체 개발 | ||
| X 선 빔 스톱 | 자체 개발 |
참고문헌
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L.
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재인쇄 및 허가
