Oppdage Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus Cell Lines
Summary
Fire metoder ble brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia, som komplementerte hverandre og forbedret deteksjonsnøyaktigheten av Wolbachia-infeksjon av Aedes albopictus-avledede Aa23 og Aa23-T kurert for innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika.
Abstract
Som en maternalt innkaiende endosymbiont infiserer Wolbachia store mengder insektpopulasjoner. Studier har nylig rapportert vellykket regulering av RNA virusoverføring ved hjelp av Wolbachia-transfekterte mygg. Viktige strategier for å kontrollere virus inkluderer manipulering av vertsreproduksjon via cytoplasmisk inkompatibilitet og hemming av virale transkripsjoner via immunpriming og konkurranse om vertsavledede ressurser. Imidlertid er de underliggende mekanismene for svarene til Wolbachia-transfekterte mygg til virusinfeksjon dårlig forstått. Dette dokumentet presenterer en protokoll for in vitro-identifisering av Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivåene i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for å forbedre forståelsen av interaksjonene mellom Wolbachia og dens insektvektorer. Gjennom kombinert bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), kvantitativ PCR, vestlig blot og immunologiske analytiske metoder er det beskrevet en standard morfologiske protokoll for påvisning av Wolbachia-infiserte celler som er mer nøyaktige enn bruk av en enkelt metode. Denne tilnærmingen kan også brukes på påvisning av Wolbachia-infeksjon i andre insekt taxa.
Introduction
Den asiatiske tiger mygg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøkkelvektor av denguevirus (DENV) i Asia og andre deler av verden1, er en naturlig vert for to typer av de intracellulære bakteriene, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som distribueres over hele bakterielinjen og somatisk vev 2,3. Aa23 cellelinjen avledet fra A. albopictus embryoer består av minst to morfologiske celletyper, som begge støtter infeksjon4 og kan kureres av innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika (Aa23-T). Gitt at Aa23 bare beholder wAlbB, er det en nyttig modell for studiet av verts-endosymbiont interaksjoner 4,5,6.
Wolbachia overføres mors og smitter anslagsvis 65% av insektarter 8,9 og 28% av myggarter10. Det infiserer en rekke vev og danner et intimt symbiotisk forhold til verten, som vanligvis induserer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populasjonserstatning ved å manipulere vertsreproduksjonssystemet12,13. Disse vertsresponsene har blitt observert i naturlige populasjoner av Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltprøve15. En viktig ikke-produktiv manipulasjon fremkalt av Wolbachia er indusert vertsmotstand mot en rekke patogener, inkludert DENV, Chikungunya virus (CHIKV) og West Nile virus (WNV)16,17, som kan formidles av et forbedret medfødt immunsystem av symbiont18,19, konkurranse mellom Wolbachia og virus for essensielle vertsressurser20, og manipulering av vert virale forsvarsbaner21 .
Denne protokollen er utviklet for å studere disse underliggende mekanismene for Wolbachia-induserte verts antivirale responser. Den bruker fire metoder for påvisning av intracellulær Wolbachia infeksjon av Aa23 celler. Disse metodene gir et sterkt teoretisk grunnlag for studier av intracellulær Wolbachia-infeksjon av andre vertsarter. Den første metoden, PCR-en kraftig teknikk som tillater enzymatisk forsterkning av spesifikke områder av DNA uten å bruke konvensjonelle kloning prosedyrer-ble brukt til å oppdage Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelse / fravær av Wolbachia infeksjon22. Den andre metoden måler Wolbachia DNA-kopitetthet ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR) for pålitelig deteksjon og måling av produkter generert under hver PCR-syklus som er direkte proporsjonal med malmengden før PCR23. Den tredje metoden oppdager tilstedeværelsen av intracellulære Wolbachia-proteiner , ved hjelp av vestlig blot-en av de kraftigste verktøyene for å oppdage spesifikke proteiner i komplekse blandinger ved å kombinere den høye separasjonskraften til elektroforese, spesifisiteten av antistoffer og følsomheten til kromogene enzymatiske reaksjoner. Den endelige metoden er en immunfluorescence analyse (IFA) som kombinerer immunologi, biokjemi og mikroskopi for å oppdage Wolbachia overflateprotein (wsp) gjennom en antigen-antistoffreaksjon for å bekrefte det cellulære opptaket av Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.
Dette dokumentet beskriver de fire metodene som er oppført ovenfor for å verifisere eksistensen av Wolbachia i cellene, som kan brukes til å oppdage om den eksogene Wolbachia ble vellykket transfektert og Wolbachia i cellen ble ryddet. Etter å ha bestemt om Wolbachia er til stede i cellene eller ikke, kan en rekke forskjellige analyser utføres, inkludert genomikk, proteomikk eller metabolomikk. Denne protokollen demonstrerer påvisning av Wolbachia gjennom Aa23-celler, men kan også brukes i andre celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Påvisning av intracellulær Wolbachia-infeksjon er avgjørende for studiet av Wolbachia-vert interaksjoner og bekreftelse av vellykket transfeksjon av celler med nye stammer. I denne protokollen ble fire metoder brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivået. Disse fire eksperimentelle metodene bekreftet og forbedret deteksjonsnøyaktigheten til Wolbachia-infeksjon av celler.
PCR ble brukt til å oppdage tilstede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for innsiktsfulle forslag og veiledning. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
