La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.
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Articolo metodologico
Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo scattering neutronico offre la possibilità di sondare la dinamica all'interno dei campioni per una vasta gamma di energie in modo non distruttivo e senza etichettatura diversa dal deuterio. In particolare, la spettroscopia di retrodiffusione neutronica registra i segnali di scattering a più angoli di scattering simultaneamente ed è adatta per studiare la dinamica dei sistemi biologici sulla scala temporale ps-ns. Impiegando D2O-e possibilmente componenti tampone deuterati, il metodo consente il monitoraggio sia della diffusione del centro di massa che dei movimenti della spina dorsale e della catena laterale (dinamica interna) delle proteine allo stato liquido.
Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione può essere studiata impiegando polveri di proteine perdeuterate idratate con H2O. Questo documento presenta il flusso di lavoro impiegato sullo strumento IN16B presso l'Institut Laue-Langevin (ILL) per studiare la dinamica delle proteine e dell'idratazione dell'acqua. Viene spiegata la preparazione di campioni di soluzione e campioni di polvere proteica idrata utilizzando lo scambio di vapore. La procedura di analisi dei dati per la dinamica delle proteine e dell'acqua di idratazione è descritta per diversi tipi di set di dati (spettri quasielastici o scansioni a finestra fissa) che possono essere ottenuti su uno spettrometro di retrodiffusione di neutroni.
Il metodo è illustrato con due studi che coinvolgono proteine amiloidi. L'aggregazione del lisozima in aggregati sferici di dimensioni μm - particolato indicato - è dimostrato che avviene in un processo in un'unica fase sull'intervallo di spazio e tempo sondato su IN16B, mentre la dinamica interna rimane invariata. Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione della tau è stata studiata su polveri idratate di proteine perdeuterate. È dimostrato che i movimenti traslazionali dell'acqua si attivano sulla formazione di fibre amiloidi. Infine, vengono discussi i passaggi critici del protocollo su come lo scattering neutronico è posizionato per quanto riguarda lo studio della dinamica rispetto ad altri metodi biofisici sperimentali.
Introduzione
Il neutrone è una particella massiccia e priva di carica che è stata utilizzata con successo nel corso degli anni per sondare campioni in vari campi, dalla fisica fondamentale alla biologia1. Per le applicazioni biologiche, lo scattering neutronico a piccolo angolo, lo scattering neutronico anelastico, la cristallografia neutronica e la riflettometria sono ampiamente utilizzati 2,3,4. Lo scattering anelastico di neutroni fornisce una misura mediata dell'insieme della dinamica senza richiedere un'etichettatura specifica di per sé e una qualità ....
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Protocollo
1. Preparare il tampone deuterato per le proteine allo stato liquido
- Sciogliere tutti i componenti del tampone in puro D2O.
- Se l'elettrodo pH è stato calibrato in H2O, regolare il pD secondo la formula pD = pH + 0,4 usando NaOD o DCl34.
NOTA: L'uso di D2 O invece di H2O potrebbe influire sulla solubilità delle proteine e potrebbe essere necessario adattare le condizioni tampone (ad esempio, con una leggera variazione della concentrazione salina).
2. Preparare le polveri H2O-idratate di proteine perdeuterate
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Risultati
L'aggregazione del lisozima in particolato è stata effettuata a 90 °C con una concentrazione proteica di 50 mg/ml in un tampone deuterato (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formazione di particolato è innescata dall'aumento della temperatura a 90 °C e avviene entro 6 ore (figura supplementare S8). L'acquisizione dei dati è stata eseguita su IN16B, come descritto nel protocollo sopra (i dati sono curati in modo permanente dall'ILL e accessibili a http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
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Discussione
La spettroscopia neutronica è l'unico metodo che consente di sondare la dinamica ps-ns mediata dall'insieme di campioni proteici indipendentemente dalle dimensioni della proteina o dalla complessità della soluzione quando viene utilizzata la deuterazione6. In particolare, sondando l'autodiffusione di gruppi proteici in soluzione, la dimensione idrodinamica di tali assemblaggi può essere determinata in modo inequivocabile. Tuttavia, il metodo è comunemente limitato dal basso flusso di neutroni, che.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Michaela Zamponi del Jülich Centre for Neutron Science presso l'Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Germania, per parte degli esperimenti di scattering neutronico condotti sullo strumento SPHERES. Questo lavoro ha beneficiato delle attività del consorzio Deuteration Laboratory (DLAB) finanziato dall'Unione Europea nell'ambito dei contratti HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e dell'attività finanziata dal UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) all'interno dell'Institut Laue Langevin EMBL DLAB nell'ambito delle sovvenzioni GR/R99393/01 e EP/C015452/1. Il sostegno della Commissione europea nell'ambito del 7° programm....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Supporto per | Non disponibile in commercio. Il referente locale sullo strumento può fornirglieli oppure possono essere prodotti sulla base di un disegno tecnico che può essere fornito dal referente locale. | ||
| Cloruro di deuterio, 35 % in peso in D2O, ≥ 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
| Ossido di deuterio (D, 99,9%) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning grasso siliconico per alto vuoto | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Etanolo 96%, EMSURE Reag. | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Essiccatore in vetro | VWR | 75871-660 | |
| Piastra essiccante in vetro, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Filo di indio, diametro 1,0 mm (0,04 pollici), Puratronic, 99,999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lisozima da albume d'uovo di gallina dializzato, liofilizzato, polvere, ~100.000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | vedi github.com/kpounot/nPDyn, funzioni del modello per il montaggio incluso anche nel software | |
| OHAUS AX324 Bilancia Adventurer, calibrazione interna | Dutscher | 92641 | |
| Anidride fosforica, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipetta ErgoOne 0,5-10 μ L | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipetta ErgoOne 100-1.000 μ L | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipetta ErgoOne 20-200 μ L | Starlab | S7100-2200 | |
| Puntale per pipetta TipOne 1.000 μ L | Starlab | S1111-6001 | |
| Puntale per pipetta TipOne 10 μ L | Starlab | S1111-3200 | |
| Puntale per pipetta TipOne 200 μ L | Starlab | S1111-0206 | |
| Soluzione di deuterossido di sodio, 40 % in peso in D2O, 99,5 % atomi D | Sigma-Aldrich | 372072 |
Riferimenti
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
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Ristampe e permessi
