प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की मात्रा का ठहराव के लिए एक अनुकूलित एकल अणु पुल-डाउन परख
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक बेहतर एकल-अणु पुल-डाउन (सिमपुल) परख का उपयोग करके प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को मापने के लिए नमूना तैयारी और डेटा विश्लेषण का वर्णन करता है।
Abstract
फॉस्फोराइलेशन एक आवश्यक पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है जो प्रोटीन फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है और सेल सिग्नलिंग परिणामों को निर्देशित करता है। प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को मापने के वर्तमान तरीके व्यक्तिगत प्रोटीन में फॉस्फोराइलेशन में विषमता को संरक्षित नहीं कर सकते हैं। सिंगल-मॉलिक्यूल पुल-डाउन (सिमपुल) परख को ग्लास कवरस्लिप पर प्रोटीन के इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना की जांच करने के लिए विकसित किया गया था, जिसके बाद सिंगल-अणु इमेजिंग की गई थी। वर्तमान तकनीक सिमपुल का एक अनुकूलन है जो एकल-अणु स्तर पर पूर्ण लंबाई झिल्ली रिसेप्टर्स के फॉस्फोराइलेशन राज्य का मजबूत परिमाणीकरण प्रदान करता है। इस तरह से हजारों व्यक्तिगत रिसेप्टर्स इमेजिंग प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन पैटर्न को मापने की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नमूना तैयारी से इमेजिंग तक अनुकूलित एसआईएमपुल प्रक्रिया का विवरण देता है। ग्लास तैयारी और एंटीबॉडी निर्धारण प्रोटोकॉल का अनुकूलन डेटा की गुणवत्ता को और बढ़ाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एकल-अणु डेटा विश्लेषण के लिए कोड प्रदान करता है जो एक नमूने के भीतर फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स के अंश की गणना करता है। जबकि यह काम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) के फॉस्फोराइलेशन पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल को अन्य झिल्ली रिसेप्टर्स और साइटोसोलिक सिग्नलिंग अणुओं के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।
Introduction
झिल्ली से जुड़े सिग्नलिंग को लिगैंड-प्रेरित झिल्ली रिसेप्टर सक्रियण और डाउनस्ट्रीम गौण प्रोटीन की भर्ती के संयोजन से ट्यून किया जाता है जो सिग्नल का प्रचार करते हैं। रिसेप्टर साइटोप्लाज्मिक पूंछ में प्रमुख टायरोसिन का फॉस्फोराइलेशन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स, या सिग्नलोसोम 1,2 के गठन को शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण सवाल यह है कि सिग्नलिंग भागीदारों की भर्ती और सेलुलर परिणामों को निर्देशित करने के लिए फॉस्फोराइलेशन पैटर्न कैसे बनाए और बनाए रखा जाता है। इसमें रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन की विषमता को समझना शामिल है, दोनों बहुतायत में और विशिष्ट फॉस्फोटायरोसिन पैटर्न में जो सिग्नलोसोम 3,4,5,6,7 की संरचना को निर्धारित करके सिग्नलिंग आउटपुट में हेरफेर करने का एक साधन प्रदान कर सकता है। हालांकि, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन से पूछताछ करने के लिए वर्तमान तरीकों में सीमाएं हैं। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के रुझानों का वर्णन करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन अर्ध-मात्रात्मक8 है और सिस्टम की विषमता पर जानकारी प्रदान नहीं करता है क्योंकि हजारों से लाखों रिसेप्टर्स एक साथ औसत हैं। जबकि पश्चिमी धब्बे विशिष्ट टायरोसिन के लिए फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एक नमूने की जांच करने की अनुमति देते हैं, वे एक ही प्रोटीन के भीतर मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन पैटर्न पर जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं। फॉस्फोटायरोसिन बहुतायत पर मात्रात्मक फॉस्फोप्रोटिओमिक्स रिपोर्ट करते हैं, लेकिन मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन का पता लगाने की सीमाएं हैं, क्योंकि ब्याज के अवशेषों को उसी पेप्टाइड (आमतौर पर 7-35 अमीनो एसिड) के भीतर स्थित होना चाहिए जो एंजाइमी पाचन 9,10,11 द्वारा उत्पन्न होता है।
ऊपर उल्लिखित सीमाओं को दूर करने के लिए, एकल-अणु पुल-डाउन (सिमपुल) परख को एकल-अणु स्तर पर बरकरार रिसेप्टर्स के फॉस्फोराइलेशन राज्यों को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है। एसआईएमपुल को पहली बार जैन एट अल 12,13 द्वारा मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स से पूछताछ के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में प्रदर्शित किया गया था। सिमपुल में, मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स को एंटीबॉडी-फंक्शनलाइज्ड ग्लास कवरलिप्स पर इम्यूनोप्रेसिपिटेटेड (आईपी) किया गया था और फिर प्रोटीन सबयूनिट नंबर के लिए एकल-अणु माइक्रोस्कोपी और जटिल घटकों12 के साथ सह-आईपी के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। किम एट अल .14 द्वारा एक संशोधन, जिसे सिमब्लॉट कहा जाता है, विकृत प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण करने के लिए सिमपुल की भिन्नता का उपयोग करने वाला पहला व्यक्ति था। सिमब्लॉट प्रोटोकॉल न्यूट्राएविडिन-लेपित कवरलिप्स का उपयोग करके बायोटिनिलेटेड सेल सतह प्रोटीन को कैप्चर करने पर निर्भर करता है, जिसे तब फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी लेबलिंग14 के साथ फॉस्फोराइलेशन के लिए जांच की जाती है। इन अग्रिमों के बावजूद, पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन की मात्रा का ठहराव अधिक मजबूत बनाने और प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू करने के लिए सुधार की आवश्यकता थी।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक अनुकूलित सिमपुल दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसका उपयोग लिगैंड स्थितियों और ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन15 की एक श्रृंखला के जवाब में बरकरार एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) के फॉस्फोराइलेशन पैटर्न को मापने के लिए किया गया था। हालांकि यह काम ईजीएफआर पर केंद्रित है, इस दृष्टिकोण को किसी भी झिल्ली रिसेप्टर और ब्याज के साइटोसोलिक प्रोटीन (पीओआई) पर लागू किया जा सकता है, जिसके लिए गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। प्रोटोकॉल नमूना ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए कदम शामिल हैं, एक नमूना सरणी डिजाइन जिसके लिए 20 नमूनों की एक साथ तैयारी के साथ न्यूनतम नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, और एंटीबॉडी लेबलिंग और निर्धारण स्थितियों का अनुकूलन होता है। फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के एकल-अणु का पता लगाने और मात्रा का ठहराव करने के लिए डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एकल प्रोटीन स्तर पर रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन के मात्रात्मक माप को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया था। सिमपुल प्रोटोकॉल में कई सरल लेकिन महत्वपूर्ण संशोधन विकसित किए गए थे …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 35 जीएम 126934, आर 01 एआई 153617 और डीएसएल के लिए आर 01 सीए 248166 द्वारा समर्थित किया गया था। ईएमबी को एएसआरटी-आईआरएसीडीए कार्यक्रम (एनआईएच के 12 जीएम088021) और यूएनएम मार्क कार्यक्रम (एनआईएच 2 टी 34 जीएम 008751-20) द्वारा जेएआर के माध्यम से समर्थित किया गया था। हम कृतज्ञतापूर्वक न्यू मैक्सिको व्यापक कैंसर केंद्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन विश्वविद्यालय का उपयोग करते हुए स्वीकार करते हैं, जो एनआईएच पी 30 सीए 118100 द्वारा समर्थित है। हम डॉ अंकुर जैन और ताइकिजिप हा को स्वीकार करना चाहते हैं, जिनके एसआईएमपुल के मूल विकास ने इस काम को प्रेरित किया।
ईएस-सी वर्तमान पता: इम्यूनोडायनामिक्स ग्रुप, एकीकृत कैंसर इम्यूनोलॉजी की प्रयोगशाला, कैंसर अनुसंधान केंद्र, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
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