En optimerad enmolekylär pull-down-analys för kvantifiering av proteinfosforylering
Summary
Detta protokoll beskriver provberedning och dataanalys för att kvantifiera proteinfosforylering med hjälp av en förbättrad enmolekylär pull-down (SiMPull) -analys.
Abstract
Fosforylering är en nödvändig posttranslationell modifiering som reglerar proteinfunktionen och styr cellsignaleringsresultat. Nuvarande metoder för att mäta proteinfosforylering kan inte bevara heterogeniteten i fosforylering över enskilda proteiner. Den enmolekylära pull-down (SiMPull) -analysen utvecklades för att undersöka sammansättningen av makromolekylära komplex via immunoprecipitation av proteiner på ett glasöverdrag följt av enmolekylär avbildning. Den nuvarande tekniken är en anpassning av SiMPull som ger robust kvantifiering av fosforyleringstillståndet för membranreceptorer i full längd på enmolekylnivå. Avbildning av tusentals enskilda receptorer på detta sätt möjliggör kvantifiering av proteinfosforyleringsmönster. Det nuvarande protokollet beskriver den optimerade SiMPull-proceduren, från provberedning till avbildning. Optimering av glasberedning och antikroppsfixeringsprotokoll förbättrar datakvaliteten ytterligare. Det nuvarande protokollet tillhandahåller kod för enmolekylär dataanalys som beräknar fraktionen av receptorer fosforylerade i ett prov. Medan detta arbete fokuserar på fosforylering av den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR), kan protokollet generaliseras till andra membranreceptorer och cytosoliska signalmolekyler.
Introduction
Membranassocierad signalering ställs in genom en kombination av ligandinducerad membranreceptoraktivering och rekrytering av nedströms tillbehörsproteiner som sprider signalen. Fosforylering av viktiga tyrosiner i receptorcytoplasmatiska svansar är avgörande för att initiera bildandet av signalkomplex eller signalosomer 1,2. Därför är en viktig fråga inom biologin hur fosforyleringsmönster skapas och upprätthålls för att rekrytera signalpartners och diktera cellulära resultat. Detta inkluderar att förstå heterogeniteten hos receptorfosforylering, både i överflöd och i de specifika fosfotyrosinmönstren som kan ge ett sätt att manipulera signalutgångar genom att diktera signalosomenssammansättning 3,4,5,6,7. Det finns dock begränsningar i nuvarande metoder för att förhöra proteinfosforylering. Western blot-analys är utmärkt för att beskriva trender för proteinfosforylering men är semikvantitativ8 och ger inte information om systemets heterogenitet eftersom tusentals till miljoner receptorer är i genomsnitt tillsammans. Medan western blots tillåter sondering av ett prov med fosfospecifika antikroppar mot specifika tyrosiner, kan de inte ge information om fosforyleringsmönster på flera platser inom samma protein. Kvantitativ fosfoproteomik rapporterar om fosfotyrosin överflöd, men det finns begränsningar för att detektera multisite fosforylering, eftersom resterna av intresse måste placeras inom samma peptid (vanligtvis 7-35 aminosyror) som genereras av enzymatisk matsmältning 9,10,11.
För att övervinna de begränsningar som nämns ovan har den enmolekylära pull-down (SiMPull) -analysen anpassats för att kvantifiera fosforyleringstillstånden för intakta receptorer på enmolekylnivå. SiMPull demonstrerades först som ett kraftfullt verktyg för att förhöra makromolekylära komplex av Jain et al.12,13. I SiMPull immunoprecipiterades makromolekylära komplex (IP) på antikroppsfunktionaliserade glasöverdrag och analyserades sedan genom enmolekylär mikroskopi för proteinunderenhetsnummer och co-IP med komplexa komponenter12. En modifiering av Kim et al.14, kallad SiMBlot, var den första som använde en variant av SiMPull för att analysera fosforylering av denaturerade proteiner. SiMBlot-protokollet förlitar sig på att fånga biotinylerade cellyteproteiner med neutrAvidin-belagda täckglas, som sedan undersöks för fosforylering med fosfospecifik antikroppsmärkning14. Trots dessa framsteg behövdes förbättringar för att göra kvantifieringen av posttranslationell modifiering mer robust och tillämplig på ett bredare spektrum av proteiner.
Det nuvarande protokollet beskriver en optimerad SiMPull-metod som användes för att kvantifiera fosforyleringsmönster för intakt epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) som svar på en rad ligandförhållanden och onkogena mutationer15. Även om detta arbete fokuserar på EGFR, kan detta tillvägagångssätt tillämpas på alla membranreceptorer och cytosoliska proteiner av intresse (POI), för vilka kvalitetsantikroppar finns tillgängliga. Protokollet innehåller steg för att minska provets autofluorescens, en provmatrisdesign som kräver minimal provvolym med samtidig beredning av upp till 20 prover och optimering av antikroppsmärkning och fixeringsförhållanden. Dataanalysalgoritmer har utvecklats för enmolekylsdetektion och kvantifiering av fosforylerade proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här optimerades för att möjliggöra kvantitativa mätningar av receptorfosforylering vid den enda proteinnivån. Flera enkla men viktiga modifieringar av SiMPull-protokollet utvecklades som förbättrade tillförlitligheten i mätningen för fosfo-tyrosindetektering, inklusive minskning av autofluorescens med NaBH4-behandling och efterfixering av provet för att förhindra antikroppsdissociation. Att använda den gröna kanalmasken för att identifiera receptorplatser för beräknin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 och R01CA248166 till DSL. EMB stöddes genom ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) och JAR av UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi erkänner tacksamt att använda University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delad resurs, som stöds av NIH P30CA118100. Vi vill uppmärksamma Drs. Ankur Jain och Taekijip Ha, vars ursprungliga utveckling av SiMPull inspirerade detta arbete.
ES-C nuvarande adress: Immunodynamics Group, Laboratoriet för integrativ cancerimmunologi, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
