التشريح المجهري بالليزر لتطبيقات الأنسجة الأحادية التي لا تعرف الأنواع
Summary
يتم وصف بروتوكول يستخدم التشريح المجهري بالليزر لعزل أنسجة الديدان الخيطية الفردية لتسلسل الحمض النووي الريبي. لا يتطلب البروتوكول مجموعات أدوات وراثية خاصة بالأنواع ، مما يسمح بمقارنة ملامح التعبير الجيني بين الأنواع المختلفة على مستوى عينات الأنسجة المفردة.
Abstract
أحدثت منهجيات الخلية الواحدة ثورة في تحليل النسخ لأنواع معينة من الخلايا. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تتطلب “مجموعات أدوات” وراثية خاصة بالأنواع ، مثل المروجين الذين يقودون التعبير الخاص بالأنسجة عن البروتينات الفلورية. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكولات التي تعطل الأنسجة لعزل الخلايا الفردية تزيل الخلايا من بيئتها الأصلية (على سبيل المثال ، الإشارات من الجيران) وقد تؤدي إلى استجابات الإجهاد أو الاختلافات الأخرى عن حالات التعبير الجيني الأصلي. في هذا البروتوكول ، تم تحسين التشريح المجهري بالليزر (LMD) لعزل أطراف ذيل الديدان الخيطية الفردية لدراسة التعبير الجيني أثناء تشكل طرف ذيل الذكور.
يسمح LMD بعزل جزء من الحيوان دون الحاجة إلى تعطيل خلوي أو مجموعات أدوات خاصة بالأنواع ، وبالتالي فهو قابل للتطبيق على أي نوع. بعد ذلك ، يمكن تطبيق بروتوكولات إعداد مكتبة RNA-seq أحادية الخلية مثل CEL-Seq2 على الأنسجة المفردة المعزولة بواسطة LMD وتحليلها باستخدام خطوط أنابيب قياسية ، بالنظر إلى أن الجينوم أو النسخ المشروح جيدا متاح للأنواع. يمكن استخدام هذه البيانات لتحديد مدى حفظ أو اختلاف النسخ التي تكمن وراء تطور هذا النسيج في الأنواع المختلفة.
تشمل القيود القدرة على قطع الأنسجة ذات الأهمية وحجم العينة. يظهر تحليل الطاقة أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 70 طرف ذيل لكل حالة للحصول على 80٪ من الطاقة. هناك حاجة إلى تزامن ضيق للتنمية للحصول على هذا العدد من الحيوانات في نفس مرحلة النمو. وبالتالي ، يتم وصف طريقة لمزامنة الحيوانات على فترات 1 ساعة.
Introduction
الديدان الخيطية – وخاصة الديدان الخيطية الرابديتيد المرتبطة بالنظام النموذجي Caenorhabditis elegans – هي مجموعة رائعة من الحيوانات لبيولوجيا التطور التطوري (EDB) لأسباب عديدة 1,2. وتشمل المزايا العدد الصغير من الخلايا ، وسلالات الخلايا المحددة والمتسقة ، والشفافية ، وسهولة الزراعة والتربية. هناك أيضا العديد من الموارد المتاحة ، بما في ذلك الجينوم عالي الجودة لأنواع متعددة ، وبالنسبة ل C. elegans ، الأدوات الوراثية الجزيئية الواسعة والمعرفة حول التنمية وعلم الوراثة والتشريح وعلم وظائف الأعضاء3،4،5،6.
كما هو الحال مع العديد من الكائنات الحية الأخرى ، فإن القدرة على توصيف ديناميكيات النسخ في الأنسجة المفردة أو الخلايا المفردة قد أحدثت ثورة في تحليل التطور في C. elegans 7,8,9,10. إن القدرة على مقارنة النسخ أحادية الخلية عبر الديدان الخيطية من شأنها أن تحول EDB بالمثل باستخدام هذه الكائنات الحية. على سبيل المثال، من شأن مثل هذه المقارنات أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تطور الشبكات التنظيمية الجينية للشخصيات (السمات) التي تم الحفاظ عليها، أو للشخصيات التي تباين، أو للشخصيات التي تطورت بشكل مستقل.
ومع ذلك ، فإن عزل أنسجة أو خلايا معينة عن الديدان الخيطية هو أحد التحديات الكبيرة. بالنسبة للعديد من الكائنات الحية، يمكن فصل الخلايا المفردة عن الأنسجة وحصادها بطريقة غير متحيزة أو يمكن تصنيفها بتعبير خاص بالأنسجة لبروتين فلورسنت وفرزها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS)11. في C. elegans ، اقتصر عزل الخلايا عالي الإنتاجية (HTP) في الغالب على الأجنة لأن البشرة الخارجية الصلبة (والهيكل العظمي الهيدروستاتيكي) أعاقت عزل الخلايا عن اليرقات والبالغين. للتغلب على هذا التحدي ، استخدمت بعض الطرق أدوات وراثية في ديدان C. elegans بأكملها ، مثل وضع علامة mRNA الخاصة بالأنسجة12 ، ومقارنات التعبير التفاضلي بين النوع البري والمسوخ التي تؤثر على نوع الخلية13. وقد تغلبت الطرق الحديثة على التحدي عن طريق إذابة البشرة لعزل النوى14 أو خلايا كاملة8،9،15. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا وزراعة الخلايا لهما عيوب واضحة تتمثل في إزالة الخلايا من سياقها التنموي أو التشريحي الطبيعي – على سبيل المثال ، بعيدا عن إشارات الخلايا الخلوية والاتصال بالمصفوفة خارج الخلية – والتي من المتوقع أن تؤثر على ملف تعريف التعبير الجيني15. علاوة على ذلك ، فإن الأدوات الوراثية والعلامات الخاصة بالأنسجة خاصة بالأنواع (أي أنه لا يمكن استخدامها إلا في C. elegans).
يوفر LMD طريقة بديلة لعزل الأنسجة دون تعطيل السياق الطبيعي للخلايا. ويسمح LMD أيضا بمقارنة النسخ من الأنسجة المتجانسة من الأنواع المختلفة دون الحاجة إلى مجموعات أدوات وراثية خاصة بالأنواع إذا كان الجينوم أو تسلسل النسخ الكامل لهذه الأنواع متاحا. يتضمن LMD استهداف الأنسجة عن طريق المراقبة المجهرية المباشرة واستخدام شعاع ليزر مجهري – مدمج في بصريات المجهر – لقطع وحصاد (التقاط) الأنسجة ذات الأهمية16. تتمثل قيود LMD في أنها لا تفضي إلى نهج HTP للغاية (على الرغم من أن ملفات تعريف النسخ لنصائح الذيل ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، كانت قوية مع حوالي 70 عينة) ، وقد يكون من الصعب تشريح بعض العينات ، وتقتصر التخفيضات على دقة الليزر وما يمكن تصوره في المجهر.
الغرض من هذا البروتوكول هو وصف كيفية استخدام LMD ، متبوعا بالحمض النووي الريبي أحادي النسيج ، للحصول على بيانات النسخ الخاصة بالمرحلة والأنسجة من الديدان الخيطية. على وجه التحديد ، فإنه يوضح LMD لعزل أطراف الذيل من يرقات المرحلة الرابعة (L4) من C. elegans. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع الأنسجة الأخرى ، وبالطبع الأنواع المختلفة.
في C. elegans ، هناك 4 خلايا تجعل طرف الذيل في كل من الذكور والخنثى. خلال مرحلة L4 في الذكور – ولكن ليس في الخنثى – تغير خلايا طرف الذيل شكلها وتهاجر أماميا وداخليا. تحدث هذه العملية أيضا في بعض أنواع الديدان الخيطية الرابديتيد الأخرى وليس كلها. لذلك ، فإن طرف الذيل هو نموذج جيد لتطور التشكل الجنسي ثنائي الشكل. بسبب موقعه ، من السهل أيضا عزل طرف الذيل بواسطة LMD.
للحصول على ملفات تعريف transcriptome من نصائح الذيل ، يستخدم البروتوكول الحالي CEL-Seq2 ، وهي طريقة RNA-seq تم تطويرها للخلايا المفردة17,18. هذه الطريقة لها العديد من المزايا للأنسجة المشتقة من LMD. يتميز CEL-Seq2 بحساسية وكفاءة عالية، حيث يستخدم معرفات جزيئية فريدة (UMIs) للسماح بالقياس الكمي المباشر لقراءات الحمض النووي الريبوزي المرسال، والنسخ في المختبر لضمان التضخيم الخطي، والترميز الشريطي الذي يسمح بتعدد الإرسال لعينات الأنسجة الفردية. القيد الوحيد ل CEL-Seq2 هو أن القراءات المستردة متحيزة إلى نهاية 3′ من mRNAs ، وبالتالي لا يمكن تمييز معظم الأشكال المتساوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة للطريقة
إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فستحصل الطريقة الموضحة هنا على ملفات تعريف RNA قوية مع عدد صغير نسبيا من العينات التي تم تشريحها بالليزر (70 نصيحة ذيل في هذا المثال). ومع ذلك ، بالنسبة للعينات من الحيوانات النامية ، فإن التزامن الضيق أمر بالغ الأهمية لتقليل التبا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (R01GM141395) و NSF (1656736) إلى DF وزمالة المعاهد الوطنية للصحة (F32GM136170) إلى AW. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.
Materials
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
- Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
- Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
- . WormBase Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022)
- . WormAtlas Available from: https://wormatlas.org (2022)
- . WormBook in Genetics Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022)
- Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
- Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
- Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
- Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
- Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
- Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
- Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
- Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
- Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
- Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
- Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
- Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
- Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
- Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
- Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
- Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
