Intracerebral infeksjon med Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) i C57BL/6-mus replikerer mange av de tidlige og kroniske kliniske symptomene på viral encefalitt og påfølgende epilepsi hos mennesker. Denne artikkelen beskriver virusinfeksjon, symptomer og histopatologi for TMEV-modellen.
En av hovedårsakene til epilepsi er en infeksjon i sentralnervesystemet (CNS); Omtrent 8% av pasientene som overlever en slik infeksjon utvikler epilepsi som en konsekvens, med priser som er betydelig høyere i mindre økonomisk utviklede land. Dette arbeidet gir en oversikt over modellering av epilepsi av smittsom etiologi og bruker den som en plattform for ny antiseizure sammensatt testing. En protokoll for epilepsiinduksjon ved ikke-stereotaktisk intracerebral injeksjon av Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) i C57BL/6-mus presenteres, som replikerer mange av de tidlige og kroniske kliniske symptomene på viral encefalitt og påfølgende epilepsi hos mennesker. Den kliniske evalueringen av mus under encefalitt for å overvåke anfallsaktivitet og oppdage potensielle antiseizure-effekter av nye forbindelser er beskrevet. Videre vises histopatologiske konsekvenser av viral encefalitt og anfall som hippocampusskader og nevroinflammasjon, samt langsiktige konsekvenser som spontane epileptiske anfall. TMEV-modellen er en av de første translasjonelle, infeksjonsdrevne, eksperimentelle plattformene som tillater undersøkelse av mekanismene for epilepsiutvikling som følge av CNS-infeksjon. Dermed tjener det også til å identifisere potensielle terapeutiske mål og forbindelser for pasienter med risiko for å utvikle epilepsi etter en CNS-infeksjon.
En av de hyppige konsekvensene av viral encefalitt er epileptiske anfall. Mange virusinfeksjoner utløser symptomatiske anfall i den akutte fasen av infeksjonen; Risikoen for slike anfall er økt med over 20% blant allmennheten 1,2,3. Pasienter som overlever infeksjonen har også en økt risiko på 4% -20% for å utvikle kronisk epilepsi i månedene til år etter infeksjon 1,4. Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) er identifisert som et egnet virus for å studere akutte og kroniske anfall i en musemodell av viral encefalitt 5,6,7. TMEV er et ikke-innkapslet, positivt, enkeltstrenget RNA-virus av Picornaviridae-familien og har tradisjonelt blitt brukt til å studere demyelinisering i ryggmargen hos SJL-mus, som C57BL/6 (B6) mus er beskyttet mot fordi de har evnen til å fjerne viruset raskt etter infeksjon. Imidlertid induserer TMEV akutte anfall hos 50% -75% av mannlige og kvinnelige B6-mus innen den første uken etter infeksjon (pi), mens ca 25% -40% utvikler kronisk epilepsi uker til måneder pi 2,5,6,8,9. Bortsett fra anfall, viser musene også den vanlige histopatologien til en epileptisk hippocampus med nevrodegenerasjon og gliose 5,6,8,10,11,12. Videre utfører TMEV-infiserte B6-mus betydelig verre i atferdstester for læring og minne og har kognitiv komorbiditet, som også ses hos kliniske pasienter med epilepsi13,14,15.
Tradisjonelt benytter modeller av epilepsi og anfall enten anvendelse av kjemokonvulsive stoffer eller elektrisk stimulering for å indusere anfall; Imidlertid mangler disse modellene konstruktiv validitet og viser ofte mer alvorlige anfall og hjerneskade enn det som er sett hos kliniske pasienter16. Det finnes ingen modell som passer for hvert forskningsspørsmål17. Bruk av TMEV-modellen er spesielt interessant hvis de predisponerende faktorene for anfallsutvikling etter en infeksjon i CNS blir undersøkt, eller hvis forbindelser screenes for deres antiseizure-effektivitet.
Siden TMEV-modellen er etablert og brukt på tvers av flere forskjellige laboratorier internasjonalt, har forfatterne identifisert mange detaljer som muliggjør vellykket implementering av modellen, for eksempel spesifisiteten til forskjellige virus- og musestammer. Den mest pålitelige anfallsinduksjonen ble generert med Daniels stamme av TMEV- og B6J-mus 2,5,6,8,9. Modellen brukes i dag av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en plattform for å identifisere nye legemidler mot epilepsi og anfall18,19. Dette papiret inneholder den detaljerte protokollen for virusinduksjon og klinisk overvåking for å tillate andre forskere å utnytte denne modellen av viral encefalitt for å fremme forståelsen av sykdomsmekanismer, samt for narkotikatesting.
Følgende protokoll gjenspeiler en studie designet for sammensatt testing i denne modellen, selv om mange andre typer studier kan utføres. Mus blir bedøvet kort før injeksjon med Daniels stamme av TMEV i den tidlige regionen av høyre halvkule (bakre og mediale til høyre øye). Avhengig av forskningsspørsmålet, hvis ikke-infiserte kontrolldyr kreves, får mus sterilt fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4, inkludert KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] og Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) i stedet forTMEV. Tidligere erfaring med TMEV-infiserte mus har indikert at håndteringsinduserte anfall oppstår mellom dag 3 og dag 7 etter infeksjon. Hyppigheten av injeksjon, rute og tid for testing av eksperimentelle forbindelser varierer i henhold til deres egenskaper. Det anbefales å utføre virusinokulasjonen på en fredag, noe som gjør at dag 3-7 anfallsovervåking kan skje uken etter, mandag-fredag. I løpet av anfallsovervåkingsuken kan eksperimentelle forbindelser administreres (i.p.) to ganger daglig (med minst 4 timers mellomrom) med mindre annet er foreslått av forbindelsens kinetikk eller virkningsmekanisme. Krampeovervåking under behandling kan utføres på et tidligere bestemt tidspunkt. Injeksjons- og observasjonstider varierer avhengig av individuelle forbindelser. Dyr injiseres med testforbindelsen eller med et kjøretøy i stedet for legemiddelforbindelsen. Disse to gruppene kan håndteres og observeres analogt med eksperimentgruppen. Under forsøket skal den ene personen som håndterer musene og skårer anfallene, blindes for behandlingen.
Dette er den første infeksjonsbaserte gnagermodellen for epilepsi som tillater undersøkelse av akutt og kronisk anfallsutvikling. Det vil bidra til å identifisere narkotikamål og nye forbindelser for sykdomsforebygging eller modifikasjon for en av de vanligste etiologiene av epilepsi.
Som beskrevet ovenfor kan det være nødvendig å vurdere batch- og virustiteren nøye for å sikre at en tilstrekkelig andel av TMEV-behandlede mus viser håndteringsinduserte anfall. Hvis dyr har færre anfall enn vanlig, bruk en gruppe N = 20 dyr for å verifisere viruseffektiviteten. Hvis aktiviteten reduseres (mindre enn 50%), er det på tide å lage nye alikoter og teste dem med N = 20 dyr. Hvis de nye alikotene ikke er mer effektive, bør en ny batch av viruset renses. For noen transgene muselinjer kan det være nødvendig å bruke en lavere viral titer; Derfor bør virustiteren fortynnes etter behov etter foreløpige eksperimenter. De fleste tilgjengelige data på B6-mus stammer fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles, Sulzfeld, Tyskland); Imidlertid er lignende anfallsrater hos B6-mus hentet fra Harlan (Eystrup, Tyskland) bekreftet8. Beslagsfrekvensen av transgene dyr med B6-bakgrunn er sammenlignbar med villtype B6-mus, men kan variere hvis de genetiske endringene har innflytelse på virusinvasjon, inflammatorisk respons eller nevrodegenerasjon21. Akutte anfall observeres spontant, men utløses av håndtering og støy, så det er av største betydning å håndtere alle dyr på samme måte når anfallsrater sammenlignes. To ganger daglig har håndteringen tidligere gitt høy anfallsbelastning og en større andel mus som viser anfall i dag 3-7 etter infeksjon 6,8,19. Ekstra håndteringstimer (dag 1 og dag 2) kan også benyttes for å øke anfallsbyrden. Videre kan dyr observeres før hver håndteringsøkt for å sikre at spontane anfall ikke forekommer. Et høyt laboratoriemiljø kan for eksempel produsere anfall, noe som igjen kan gjøre dyr motstandsdyktige mot håndteringsinduserte anfall under testtider.
Mens TMEV-infeksjon produserer håndteringsinduserte anfall hos de fleste mus, er det ukjent hvorfor noen dyr er resistente mot denne behandlingen. Som beskrevet ovenfor kan det være at elektrografiske anfall (med minimal eller ingen assosiert atferd) forekommer og normalt ikke kvantifiseres uten samtidig EEG-registrering. Det kan også være at små forskjeller i injeksjonsplassering letter redusert viral effekt i hjernen; Imidlertid er anfall rapportert etter kortikal og striatale infeksjon 5,6,8,9 på grunn av virusets tropisme til hippocampus. For narkotikascreeningstudier i denne modellen, for å identifisere en reduksjon i anfall (f.eks. en 50% reduksjon i anfallsbyrden), er det nødvendig med et større antall dyr for hver gruppe (f.eks. N = 20). Videre nødvendiggjør variasjonen i anfallsatferd i denne modellen større forskjeller i narkotika vs. kjøretøyeffekter for å identifisere en signifikant anfallsreduksjon. En begrensning ved denne modellen er derfor kravet om større gruppestørrelser. Likevel gir tilstrekkelige gruppestørrelser også mulighet for identifisering av anfallsdempende og betennelsesdempende effekter i denne modellen19.
De aller fleste observerbare anfall i denne modellen skjer i løpet av den akutte infeksjonsperioden. Til tross for forekomsten av hippocampus degenerasjon, immuncelleaktivering og kognitive underskudd observert hos mus behandlet med TMEV, utvikler bare en liten del av de behandlede dyrene til slutt kroniske, spontane anfall. Denne lave totale anfallsbyrden vil kreve et stort antall infiserte mus for å kunne studere spontane anfall på riktig måte i denne modellen, noe som er utenfor omfanget og evnen til mange prosjekter. Dybdeelektrodeimplantasjon og EEG-overvåking vil også øke belastningen på forsøksdyrene. Mens dybdeelektroder kan hjelpe til med å identifisere spontan anfallsaktivitet, kan endringer i hippocampus-anatomi etter infeksjon gjøre konsekvent elektrodeplassering til en utfordring.
Det presserende behovet for å identifisere nye behandlinger for epilepsi krever utvikling av modeller som kan brukes som en rask screeningmetode for antiseizure effekt. Denne modellen inneholder funksjoner for å håndtere denne presserende forespørselen. Videre gjør det faktum at det ikke krever noen stereotaktisk kirurgi det til en egnet og lett å utføre modell for undersøkelse av antiseizure-forbindelser.
The authors have nothing to disclose.
SB støttes av et starttilskudd fra FU Berlin. KSW støttes av R37 NS065434 og ALSAM Foundation. LAB støttes av en D-SPAN award 1F99NS125773-01. Vi takker Robert Fujinami, Ph.D. for å gi oss Theiler-viruset og University of Utah Cell Imaging Core Facility for mikroskopistøtte.
Absorbent paper | – | – | any |
Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
Ice bucket | – | – | any |
Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |