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Chemistry

化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63677
, , , ,
1Department of Chemistry,Purdue University

Summary

この論文では、同じ顕微鏡プラットフォームに統合された誘導ラマン散乱(SRS)とコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)の解像度、感度、イメージングコントラストを直接比較します。結果は、CARSの空間分解能が優れており、SRSはコントラストとスペクトル分解能が優れており、どちらの方法も感度が類似していることを示しています。

Abstract

刺激ラマン散乱(SRS)およびコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)顕微鏡は、最も広く使用されているコヒーレントラマン散乱イメージング技術です。ハイパースペクトルSRSおよびCARSイメージングは、すべてのピクセルでラマンスペクトル情報を提供し、異なる化学組成のより良い分離を可能にします。どちらの技術も2つの励起レーザーを必要としますが、それらの信号検出スキームとスペクトル特性はまったく異なります。このプロトコルの目標は、ハイパースペクトルSRSとCARSイメージングの両方を単一のプラットフォームで実行し、異なる生物学的サンプルをイメージングするための2つの顕微鏡技術を比較することです。スペクトル集束法は、フェムト秒レーザーを用いてスペクトル情報を取得するために採用されています。標準的な化学サンプルを使用することにより、同じ励起条件におけるSRSとCARの感度、空間分解能、スペクトル分解能(すなわち、サンプルでのパワー、ピクセル滞留時間、対物レンズ、パルスエネルギー)が比較されます。生体サンプルのCARSとSRSのイメージングコントラストを並置して比較します。CARSとSRSの性能を直接比較することで、化学イメージングのモダリティを最適に選択することができます。

Introduction

ラマン散乱現象は、1928年にC. V. Raman1によって初めて観測された。入射光子がサンプルと相互作用しているとき、非弾性散乱事象が自発的に起こり得、光子のエネルギー変化は分析された化学種の振動遷移と一致する。このプロセスでは、化学タグを使用する必要がないため、サンプルの摂動を最小限に抑えながら、化学分析のための汎用性の高いラベルフリーツールになります。その利点にもかかわらず、自発的ラマン散乱は、低散乱断面(典型的には赤外線[IR]吸収断面よりも1011 低い)に悩まされ、分析2のために長い取得時間を必要とする。したがって、ラマン散乱プロセスの感度を高めるための探求は、ラマン技術をリアルタイムイメージングに推進する上で不可欠です。

ラマン散乱の感度を大幅に高める効果的な方法の1つは、コヒーレントラマン散乱(CRS)プロセスによるものであり、そのために2つのレーザーパルスが分子振動遷移を励起するために典型的に使用される3,4。2つのレーザー間の光子エネルギー差がサンプル分子の振動モードと一致すると、強いラマン信号が生成されます。イメージングに最も一般的に使用される2つのCRSプロセスは、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)と刺激ラマン散乱(SRS)5です。過去20年間、技術開発により、CARSおよびSRS顕微鏡技術が進歩し、生体サンプル中の標識のない定量化および化学変化の解明のための強力なツールになりました。

CARS顕微鏡による化学イメージングは、Duncanら6によって実証されたように、レーザースキャニングがCARS画像を取得するために最初に適用された1982年にさかのぼることができます。CARS顕微鏡の近代化は、レーザー走査型多光子蛍光顕微鏡7の幅広い応用の後、大幅に加速されました。高繰り返し速度レーザーを使用したXieグループの初期の研究は、CARSを生物学的サンプル中の分子の特性評価のための高速、ラベルフリーの化学イメージングプラットフォームに移行しました8,9,10。CASイメージングの主な問題の1つは、非共振背景の存在であり、これは画像のコントラストを低下させ、ラマンスペクトルを歪める。非共鳴バックグラウンド11、12、13、14、15を減少させるか、またはCARSスペクトル16、17から共鳴ラマン信号を抽出するために多くの努力がなされている。この分野を大幅に進歩させたもう1つの進歩は、ハイパースペクトルCARイメージングであり、これは改善された化学的選択性18、19、20、21で各画像ピクセルでのスペクトルマッピングを可能にする。

刺激ラマン散乱(SRS)は、CARSよりも若いイメージング技術ですが、22年初めに発見されました。2007年に、低繰り返し率レーザー光源23を用いたSRS顕微鏡法が報告された。まもなく、いくつかのグループは、高繰り返し速度レーザー24、25、26を用いた高速SRSイメージングを実証した。CARSに対するSRS顕微鏡法の主な利点の1つは、非共振バックグラウンド27がないことであるが、クロスフェーズ変調(XPM)、過渡吸収(TA)、2光子吸収(TPA)、および光熱(PT)効果などの他のバックグラウンドがSRS28で起こり得る。さらに、SRS信号およびサンプル濃度は、二次信号濃度依存性を有するCARSとは異なり、線形関係を有する29。これにより、化学定量とスペクトルアンミキシングが簡素化されます。マルチカラーおよびハイパースペクトルSRSは、異なる形態30、31、32、33、34、35、36で進化しており、スペクトル集束は化学イメージングのための最も一般的なアプローチの1つである37,38。

CARSとSRSの両方は、信号励起のための分子の振動遷移に一致させるために、ポンプとストークスレーザービームをサンプルに集束させる必要があります。CARS顕微鏡とSRS顕微鏡にも多くの共通点があります。しかし、これら2つのプロセスの根底にある物理学と、これらの顕微鏡技術に関わる信号検出には、3,39の格差があります。CARSは、正味の光子-分子エネルギー結合3を持たないパラメトリックプロセスである。しかし、SRSはノンパラメトリックプロセスであり、光子と分子系27との間のエネルギー移動に寄与する。CARSでは、アンチストークス周波数で新しい信号が生成されますが、SRSはポンプとストークスレーザービーム間のエネルギー移動として現れます。

CARS 信号は Eq (1)28 を満たします。

Equation 1 (1)

一方、SRS信号はEq(2)28と書くことができる。

Equation 1(2)

ここで、Ip、Is、I CARSおよびΔISRSは、それぞれポンプビーム、ストークスビーム、CARS信号、およびSRS信号の強度である。χ(3) はサンプルの 3 次非線形光学感受性であり、実数部と虚数部で構成される複素数値です。

これらの方程式は、CARSとSRSのスペクトルプロファイルと信号濃度依存性を表します。物理学の違いにより、これら2つの顕微鏡技術の検出スキームが異なります。CARSにおける信号検出は、通常、新たに生成された光子のスペクトル分離と、光電子増倍管(PMT)または電荷結合素子(CCD)を用いた検出を伴う。SRSの場合、ポンプビームとストークスビーム間のエネルギー交換は、通常、光変調器を使用した高速強度変調と、ロックインアンプと対になったフォトダイオード(PD)を使用した復調によって測定されます。

近年、CARとSRSの両方の分野で多くの技術開発と応用が発表されていますが、特にハイパースペクトルCARSとSRS顕微鏡では、2つのCRS技術の体系的な比較は同じプラットフォーム上で行われていません。感度、空間分解能、スペクトル分解能、および化学分離能力を直接比較することで、生物学者は化学定量に最適なモダリティを選択できます。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーシステムとスペクトル集束に基づくハイパースペクトルCARモダリティとSRSモダリティの両方を備えたマルチモーダルイメージングプラットフォームを構築するための詳細な手順が提供されます。2つの技術は、スペクトル分解能、検出感度、空間分解能、および細胞のイメージングコントラストについて順方向で比較されてきた。

Protocol

1. ハイパースペクトルCRSイメージングのための機器セットアップ メモ:CRS信号の生成には、高出力(クラス3Bまたはクラス4)レーザを使用する必要があります。安全プロトコルに対処し、このような高いピーク電力で作業する場合は、適切な個人用保護具(PPE)を常に着用する必要があります。実験する前に、適切なドキュメントを参照してください。このプロトコ…

Representative Results

スペクトル分解能の比較図2は、DMSOサンプルを用いたハイパースペクトルSRS(図2A)およびCARS(図2B)顕微鏡のスペクトル分解能を比較したものである。SRSスペクトルについては、スペクトルに適合するように2つのローレンツ関数(プロトコルステップ2.3を参照)を適用し、2,913cm-1ピークを用いて14.6cm-1の分解?…

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、マルチモーダルCRS顕微鏡の構築と、CARSとSRSイメージングの直接比較について説明しています。顕微鏡の構築にとって重要なステップは、空間的および時間的なビームのオーバーラップとビームサイズの最適化です。SNRを最適化し、ラマンシフトを較正するために、生物学的イメージングの前にDMSOなどの標準サンプルを使用することをお勧めします。CARS画像とS…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、パデュー大学化学科のスタートアップファンドの支援を受けました。

Materials

2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25×36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110
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