Den nuværende protokol beskriver forberedelsen og visualiseringen af fast væv i Drosophila pupal notum. Det kan bruges til enten intakt eller såret væv, og vævets oprindelige arkitektur bevares. Procedurerne for dissekering, fastgørelse og farvning er alle beskrevet i denne artikel.
Pupperne af Drosophila melanogaster er immobile i flere dage under metamorfose, hvor de udvikler en ny krop med et tyndt gennemsigtigt voksent integument. Deres immobilitet og gennemsigtighed gør dem ideelle til in vivo live imaging eksperimenter. Mange undersøgelser har fokuseret på det dorsale epitelmonolag af pupal notum på grund af dets tilgængelighed og relativt store størrelse. Ud over undersøgelserne af epitelmekanik og udvikling har notum været et ideelt væv til at studere sårheling. Efter en skade kan hele epitelreparationsprocessen fanges ved levende billeddannelse over 6-12 timer. På trods af populariteten af notum til levende billeddannelse har meget få offentliggjorte undersøgelser brugt faste notumprøver. Fiksering og farvning er almindelige tilgange til næsten alle andre Drosophila-væv, der udnytter det store repertoire af enkle cellulære pletter og antistoffer. Imidlertid er pupal notum skrøbelig og tilbøjelig til at krølle og forvrængning efter fjernelse fra kroppen, hvilket gør det udfordrende at supplere levende billeddannelse. Denne protokol tilbyder en ligetil metode til fastgørelse og farvning af pupal notum, både intakt og efter laser-såring. Med denne teknik limes den ventrale side af puppen ned til et dækslip for at immobilisere puppen, og notum fjernes forsigtigt, fastgøres og farves. Notumepitelet er monteret på et dias eller mellem to dæksler for at lette billeddannelse fra vævets dorsale eller ventrale side.
Pupal notum af Drosophila melanogaster er i stigende grad blevet brugt til levende billeddannelsesundersøgelser i det sidste årti, fordi dyret er både immobilt og har en gennemsigtig kutikel på dette stadium 1,2,3,4,5,6,7. Imidlertid er pupal notum udfordrende at dissekere og rette, hvilket gør det vanskeligt at supplere levende billeddannelsesundersøgelser med antistof og cellefarvning. Det overordnede mål med dette arbejde er at skabe en reproducerbar protokol til dissekering og fastgørelse af pupal notum for antistof og cellefarvning på nye eller tidligere levende afbildede prøver.
Når larver begynder metamorfose, trækker epidermis sig væk fra larvebåndet og danner en hård puppekasse8. Larvekropsplanen nedbrydes, og den nye voksenkropsplan udvikles. I løbet af denne tid er pupper immobile, hvilket gør dem ideelle til levende billeddannelse. Et almindeligt afbildet væv er pupal notum, et voksent monolagsepitel, der dannes i den dorsale thorax. Notum er visuelt tilgængelig efter en simpel dissektion for at fjerne puppehuset9. Hele dyret kan derefter monteres, og notum kan levende afbildes i timer eller dage, hvilket gør det til et ideelt væv til at studere epitelcelleadfærd under udvikling, homeostase og efter såring 10,11,12,13,14. Notum er imidlertid udfordrende at dissekere og rette, fordi det er skrøbeligt og dækket af en tynd gennemsigtig voksen kutikel, der er hydrofob. Denne hydrofobe kutikle gør den tilbøjelig til at krølle i vandige opløsninger, når den fjernes fra resten af kroppen. Således er notum dissektion og fiksering kun sjældent blevet rapporteret, og dissektionen er ofte ikke beskrevet 15,16,17,18. Uden en detaljeret protokol i litteraturen er det uoverkommeligt vanskeligt for en Drosophila-forsker at supplere levende billeddannelse med farvning af pupper.
Denne teknik har til formål at reproducere dissekere og fiksere prøver, der tidligere er blevet levende afbildet, herunder dem, der er blevet lasersårede. Fordi levende billeddannelse kræver fjernelse af puppehuset, begynder denne dissektionsteknik med at fjerne den forreste puppesag, i modsætning til tidligere protokoller, der fastgør eller skærer pupper inden for puppesagen 4,19,20. Notum er et skrøbeligt væv, og sår kan forværre dets skrøbelighed. For at understøtte dette sarte væv dissekeres integumentet (epitelet og den vedhæftede gennemsigtige voksne kutikel) af notum og en del af hovedet og maven således væk fra resten af puppen, mens den altid er nedsænket i et vandigt miljø. Denne metode reducerer sandsynligheden for, at vævet krøller og er ubrugeligt. Denne teknik har med succes farvet såret notumvæv så tidligt som 30 minutter efter såring (figur 1E-H) og ved 3 timer efter såring (figur 1I-L). Denne protokol forventes at være effektiv i løbet af notumudvikling eller sårreparation. Den nuværende teknik vil være nyttig for forskere, der ønsker at forene puppenolumets levende billeddannelsesfunktioner med overflod af tilgængelige immunhistokemiske reagenser.
Kritiske skridt
Optimering af tre trin vil dramatisk øge succesen med denne protokol. Først i trin 1.5 skal du være sparsom med klæbelimen, der påføres dækslen. Hvis der tilsættes for meget klæbende lim, kan pupperne blive begravet i et tykt lag størknet klæbende lim, hvilket vil gøre dissektion umulig, og hvis den dækker selve notummet, vil klæbelimen okkludere lyset fra prøven. For det andet skal du i trin 2.3-2.6 sørge for kun at fjerne notumets øverste kuppel, eksklusive så meget af det laterale væv som muligt. Hvis det er inkluderet, vil det laterale væv blive komprimeret under monteringen og få midten af notumet til at spænde indad, hvilket ofte placerer det uden for arbejdsafstanden for høje numeriske blændemål. For det tredje skal der under rengøringstrin 2.9 udvises ekstrem forsigtighed for ikke at beskadige monolagsepitelet. Hvis vævet har store portioner, der mangler, eller der ikke kan detekteres noget signal, vil dette trin sandsynligvis skyldes.
Fejlfinding
Udgave 1: Efter montering kommer puppen væk fra det dobbeltsidede tape under dissektion. Dette er et almindeligt problem, især for begyndere. Det bedste middel er at sikre, at ydersiden af puppekassen er helt tør/fri for madrester. Fjernelse af mad med et par stumpe tang og lade sagen lufttørre i 10-15 minutter hjælper med at klæbe til båndet. Alternativt kan du bruge den ikke-dominerende hånd og et par stumpe tang til at holde pupperne nede mod båndet under dissektion. Hvis problemet fortsætter, giver påføring af en lille, 5-10 μL dråbe neglelak på bunden af den bageste ende af sagen og lade den hærde generelt tilstrækkelig vedhæftning til selv den mest urerulieret af pupper.
Udgave 2: Notum kollapser under trin 2.3, eller det oprindelige brud gennem integumentet er ikke glat. Hvis integumentet er vanskeligt at bryde, kan der være for meget klæbende lim fra immobiliseringstrinnene. Placering af de dissekerede pupper i mindre klæbende lim vil forbedre dette problem. Sørg desuden for, at mikrodissektionsaksen er skarp. Stump saks vil ikke være i stand til at skære ind i integumentet og har tendens til at få det til at kollapse indad. Når hæmolymfe spildes ud af pupperne, skal du sørge for, at et af skærebladene kan komme ind i puppen uden at få notum til at deformere. Hvis notum kollapser, og bladet ikke kommer ind i puppen, skal du fortsætte med at klippe, indtil et blad kommer ind i pupperne.
Udgave 3: Under trin 2.4 fanger eller trækker saksen integumentet. Hvis saksen begynder at fange eller trække integumentet, hjælper det ofte at skifte til den modsatte side af pupperne og fortsætte med at ‘løsne’ integumentet. Yderligere stump mikrodissektionssaks vil gøre det vanskeligt at opnå rene snit gennem integumentet, og skærpet saks skal bruges.
Udgave 4: Prøven aspireres ved et uheld under farvning (trin 3.1-3.6). Det dissekerede notum er udfordrende at se, fordi det er gennemsigtigt. Det kan være nyttigt at placere et mørkeblåt eller sort ark under dækskortet for at give kontrast (et gammelt pipettespidsholderstativ fungerer godt.) Derudover kan alle opløsningsændringer udføres under et dissektionsmikroskop.
Problem 5: Der registreres intet signal/der registreres et ujævnt signal. Efter at have udelukket pletspecifikke problemer, hvis der ikke registreres noget signal, eller det er ujævnt, er trin 2.9 (rengøring) sandsynligvis synderen. Et fraværende eller ujævnt signal kan stamme fra beskadigelse og fjernelse af epitelvævet under rengøring. Omvendt kan et dårligt signal skyldes okklusion fra muskelbåndene/fedtkropscellerne, hvis de ikke fjernes, da de kan begrænse diffusionen af pletter og antistoffer i notum i forhold til det omgivende væv. Hvis vævet er beskadiget, er det den bedste løsning at være blidere under rengøring. Hvis pletten i stedet er synlig, men ujævn, anbefales det at øge kraften / tiden dedikeret til rengøringstrinnet for at fjerne så meget af muskel- og fedtkroppen som muligt. Yderligere kan forøgelse af plettens varighed hjælpe med at løse dette problem med bedre rengøring.
Udgave 6: Notumvævet har et skævt / rynket udseende under billeddannelse. Vridning og rynker af vævet kommer fra to kilder. For det første vil komprimering af notum under montering få det til at spænde og kæde. Den bedste løsning er at fjerne så meget af det laterale væv som muligt, så kuplen er så kort som muligt og kan passe mellem dækslip-afstandsstykkene. For det andet, hvis notum er bøjet under dissektion, vil denne bøjning ikke rette sig ud under monteringen, så der skal udvises ekstra omhu for ikke at fordreje notum under dissektion. Utilsigtet bøjning af notum er mest almindelig, når man skærer integumentet væk fra resten af pupperne. Det er fristende at have dissektionssaksen i en vinkel i forhold til pupperne i stedet for at holde dem i prøveplanet som pupper. Vinklet saks får dog integumentet til at spænde opad, når det skæres i stedet for at forblive fladt.
Eksisterende metoder, begrænsninger og fremtidige applikationer
Wang et al.20 rapporterede en sammenlignelig dissektionsprotokol for isolering af puppeepitel. Denne teknik kræver, at puppen forbliver inden for sin sag og hurtigt gennemskæres med en skalpel. Denne protokol er uforenelig med tidligere levende afbildede prøver, da levende billeddannelse kræver fjernelse af en stor del af puppehuset. Fordi pupper mangler stivhed, manglede puppebisektion uden for sagen vævet og inspirerede oprettelsen af denne protokol. Teknikken, der er beskrevet her, giver mulighed for isolering og fiksering af notum, og den kan bruges som det første skridt til en lang række andre metoder såsom kryosectioning, in situ-hybridisering eller elektronmikroskopi.
Denne teknik har nogle begrænsninger. For det første er dissekering, fastgørelse og farvning af notum mere tidskrævende end levende billeddannelse fluorescerende mærkede proteiner i notum, hvilket kun kræver en simpel dissektion for at fjerne puppehuset 9,23. For det andet er denne dissektion vanskeligere sammenlignet med dissektioner af andre Drosophila-væv på grund af det tynde, skrøbelige væv og hydrofobe kutikling. For blot at visualisere proteiner i Drosophila epithelia er immunhistokemi på faste embryoner, larvevingeskiver eller æggestokke lettere. Denne teknik gør det imidlertid muligt at parre kraften i levende billeddannelse med fiksering og farvning, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj, når det først er mestret.
En dissektions- / fikseringsteknik har nogle fordele i forhold til levende billeddannelse. Basal (indvendige) strukturer kan løses bedre med en basal visning (figur 5L,J). Vigtigst er det, at levende billeddannelse er begrænset til fluoroforer, der skal leveres genetisk, hvilket ofte kræver lange genetiske krydsningsordninger. I modsætning hertil tillader den nuværende protokol anvendelse af pletter, immunhistokemi og andre teknikker, der kræver dissektion og fiksering. Dette øger dramatisk antallet af signaler, der undersøges i vævet, samtidig med at det potentielt reducerer tiden til eksperimentelle resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. M. Shane Hutson for at etablere laserablationssystemet, der bruges til puppesår og hans bidrag til og feedback om udvikling af protokollen. Dette arbejde blev støttet af 1R01GM130130 til APM og M. Shane Hutson. JW blev understøttet af 2T32HD007502-21.
½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
NIS Elements Software | Nikon | AR | |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |