הפרוטוקול מציג שיטה להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות ריאה ראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המנצלים בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה
במאמר זה
סיכום
תקציר
היעדר מודל חוץ גופי חזק של אפיתל הנשימה האנושי מעכב את הבנת הביולוגיה והפתולוגיה של מערכת הנשימה. אנו מתארים פרוטוקול מוגדר להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי גזע בוגרים ברקמת הריאה ולגרום להתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה. האורגנואידים של הריאה מורחבים ברציפות במשך למעלה משנה עם יציבות גבוהה, בעוד שהאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה משמשים כדי לדמות באופן מורפולוגי ותפקודי אפיתל דרכי הנשימה האנושי לרמה כמעט פיזיולוגית. לפיכך, אנו יוצרים מודל אורגנואידי חזק של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. ההתרחבות ארוכת הטווח של אורגנואידים של ריאה ואורגנואידים מובחנות של דרכי הנשימה מייצרת מקור יציב ומתחדש, ומאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את תאי האפיתל של דרכי הנשימה האנושיות במנות תרבית. מערכת האורגנואידים של הריאה האנושית מספקת מודל ייחודי ופעיל מבחינה פיזיולוגית במבחנה עבור יישומים שונים, כולל חקר אינטראקציה בין נגיף למארח, בדיקות תרופות ומידול מחלות.
מבוא
אורגנואידים הפכו לכלי חזק ואוניברסלי למידול חוץ גופי של התפתחות איברים ולחקר ביולוגיה ומחלות. כאשר מתרבים בתרבית במדיום תרבית המוגדר על ידי גורם גדילה, תאי גזע בוגרים (ASC) ממגוון איברים ניתנים להרחבה בתלת-ממד (3D) ולהרכיב את עצמם לאשכולות תאיים דמויי איברים המורכבים מסוגי תאים מרובים, המכונים אורגנואידים. המעבדה של Clevers דיווחה על הנגזרת של האורגנואיד הראשון שמקורו ב-ASC, אורגנואיד מעיים אנושי, בשנת 2009 1,2. לאחר מכן, אורגנואידים שמקורם ב-ASC הוקמו עבור מגוון של איברים ורקמות אנושיות, כולל ערמונית 3,4, כבד 5,6<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת הונג קונג / רשות בתי החולים של הונג קונג אשכול מערב הונג קונג (UW13-364 ו- UW21-695). הסכמה מדעת התקבלה מחולים לפני איסוף הרקמות.
1. גזירת אורגנואיד ריאה אנושית
- הכנת חומרים ניסיוניים
- הכן מדיום בסיסי על ידי תוספת למדיום DMEM/F12 מתקדם עם 2 mM גלוטמין, 10 mM HEPES, 100 U /mL של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין.
- הכן את מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה האנושית על ידי השלמת מדיום בסיסי עם 10% R-spondin 1 בינוני מותנה, 10% בינוני מותנה נוג'ין, תוסף B27 1x, 1.25 mM N-אצטילציסטאין, 10 mM ניקוט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מאפשר נגזרת של אורגנואידים של ריאה אנושית עם שיעור הצלחה גבוה. רקמת ריאה אנושית טרייה טחונה לחתיכות קטנות, ולאחר מכן מתפרקת עם קולגן. התאים הבודדים המתקבלים מוטמעים במטריצת המרתף ומודגרים במדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה בתוספת קוקטייל של גורמי נישה לצמיחת תאי גזע אפיתליאליים (שלב 1.1.2). איור 1 מראה את המיקרו-צילום של תאי ריאה שזה עתה בודדו, המוטמעים במטריצת ממברנת מרתף של גורם גדילה מופחת מסוג 2 (BME; איור 1A, משמאל). אורגנואידים ציסטיים מופיעי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דרכי הנשימה האנושיות מרופדות באפיתל דרכי הנשימה, הידוע גם בשם אפיתל הציליאתי המדומה. סוגי התאים העיקריים של אפיתל דרכי הנשימה העליונות הם תאים מצומדים המאפשרים לתנועה מתואמת של הריסונים האפיקליים שלהם לגרש ריר וחלקיקים בשאיפה מדרכי הנשימה, תאי גביע המייצרים ומפרישים ריר, ותאי בסיס התוחמים את קרום המרתף ומעורבים בהתחדשות. בדרכי הנשימה הקטנות כמו ברונכיולס, אפיתל דרכי הנשימה הקובואידלי מכיל תאי מועדון מפרישים ופחות תאים מצומדים מאשר באזורי דרכי הנשימה העליונים. אנו מתארים פרוטוקול חזק להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מתאי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
J. Z., C.L., ו- M.C.C. רשומים כממציאים בפטנט של אורגנואידים של דרכי הנשימה (פרסום מס': US-2021-0207081-A1). המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים למרכז למדעי PanorOmic וליחידת מיקרוסקופ אלקטרונים, הפקולטה לרפואה ע"ש לי קה שינג, אוניברסיטת הונג קונג, על הסיוע בהדמיה קונפוקלית ובציטומטריית זרימה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מקרן המחקר לבריאות ורפואה (HMRF, 17161272 ו-19180392) של לשכת המזון והבריאות; קרן המחקר הכללית (GRF, 17105420) של המועצה למענקי מחקר; Health@InnoHK, ועדת החדשנות והטכנולוגיה, ממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ריאגנטים חזקים>ריאגנטים לתרבית אורגנואידים ריאתיים | |||
| מתקדמים DMEM/F12 | Invitrogen | ||
| 12634010-A8301 | Tocris | 2939 | תוסף 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, סוג 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | פפרוטק | 100-26 | 20 ננוגרם/מ"ל |
| FGF-7 | פפרוטק | 100-19 | 5 ננוגרם/מ"ל |
| גלוטמקס (גלוטמין) | Invitrogen | 35050061 1x | |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 מ"מ |
| הרגולין ובטא;-1 | פפרוטק | 100-03 | 5 ננומטר |
| N-אצטילציסטאין | סיגמא-אולדריץ' | A9165 | 1.25 מ"מ |
| ניקוטינאמיד | סיגמא-אולדריץ' | N0636 | 10 מ"מ |
| נוגין (מדיום מותנה) | תוצרת | בית-10x | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| פרימוצין | Invivogen | ant-pm-1 | 100 ומיקרו; גרם/מ"ל |
| Rspondin1 (בינוני מותנה) | תוצרת | בית-10x | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 ומיקרו; M |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 ומיקרו; M |
| <חזק>תווך התמיינות פרוקסימלי | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 ומיקרו; M |
| Heparin Solution | טכנולוגיית תאי גזע | 7980 | 4 ומיקרו; g/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | טכנולוגיית תאי גזע | 7925 | 1 ומיקרו; M |
| PneumaCult-ALI 10X תוסף | ממשק נוזלי אוויר תוסף | ||
| PneumaCult-ALI בזל בינוני | טכנולוגיית תאי גזע | 05001 | ממשק נוזלי אוויר בינוני |
| בסיסי PneumaCult-ALI תוסף תחזוקה תוסף | תחזוקה ממשק נוזלי אוויר | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 ומיקרו; M |
| ציוד | |||
| ארון בטיחות ביולוגי | אופה | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 או 800 | Zeiss | מיקרוסקופ קונפוקלי | |
| CO2 אינקובטור | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| סטריאו-מיקרוסקופ | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| צנטריפוגה | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| פיפטור סרולוגי | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN שחור או ZEN כחול תוכנה | Zeiss | לניתוח | |
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| 12 מ"מ טכנולוגיית Trans-well | StemCell | #38023 | |
| צלחת תרבית תאים 12 בארות | Cellstar | 665970 | |
| צינורות חרוטיים 15 ו-50 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| צלחת תרבית תאים 24 בארות | Cellstar | 662160 | |
| 6.5 מ"מ טכנולוגיית תאי גזע טרנס-באר | #38024 | ||
| יחידת מסנן מזרק רפואי, 0.22 ומיקרו; m | צינורות מיקרופוגה SLGPR33RB סיגמא-אולדריץ' | ||
| <נוגדנים חזקים> | |||
| עזים נגד עכבר Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| עז נגד עכבר, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| עז נגד ארנב Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| עז נגד חולדה Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| עכבר אנטי ציטוקרטין 5 | Abcam | ab128190 | |
| עכבר אנטי-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| עכבר נגד מוצין 5AC | Abcam | ab3649 | |
| עכבר אנטי &בטא;-טובולין 4 | סיגמא | T7941 | |
| ארנב אנטי-p63 | Abcam | ab124762 | |
| חולדה אנטי-אוטרוגלובין/CC-10 | R& D Systems | MAB4218-SP | |
| strong>Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | דיסוציאציה אנזים |
מקורות
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. S....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
