Omvänd genetik för att konstruera RNA-virusvarianter med positiv känsla

Summary

Protokollet beskriver en metod för att introducera kontrollerbar genetisk mångfald i hepatit C-virusets genom att kombinera fullängdsmutant RNA-syntes med hjälp av felbenägen PCR och omvänd genetik. Metoden ger en modell för fenotypselektion och kan användas för 10 kb långa RNA-virusgenom.

Abstract

Bristen på en bekväm metod för iterativ generering av olika virala varianter i full längd har försvårat studiet av riktad evolution i RNA-virus. Genom att integrera en fullständig PCR i RNA-genomet och omvänd genetik kan slumpmässig substitutionsmutagenes induceras. Vi har utvecklat en metod som använder denna teknik för att syntetisera olika bibliotek för att identifiera virala mutanter med fenotyper av intresse. Denna metod, som kallas fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS), erbjuder följande fördelar: (i) förmågan att skapa ett stort bibliotek via en mycket effektiv enstegs felbenägen PCR; ii) förmågan att skapa grupper av bibliotek med olika nivåer av genetisk mångfald genom att manipulera DNA-polymerasets trohet, iii) Skapande av en fullängds-PCR-produkt som direkt kan tjäna som mall för mutant RNA-syntes. och (iv) förmågan att skapa RNA som kan levereras in i värdceller som en icke-selekterad ingångspool för att screena för virala mutanter av den önskade fenotypen. Vi har funnit, med hjälp av en omvänd genetisk metod, att FL-MRS är ett tillförlitligt verktyg för att studera virusriktad evolution i alla stadier i livscykeln för hepatit C-viruset, JFH1-isolatet. Denna teknik verkar vara ett ovärderligt verktyg för att använda riktad evolution för att förstå anpassning, replikation och rollen av virala gener i patogenes och antiviral resistens i positiva RNA-virus.

Introduction

Framåtriktad genetisk screening börjar med en viral fenotyp av intresse och försöker sedan, genom att sekvensera dess genom och jämföra den med den ursprungliga stammens, identifiera den eller de mutationer som orsakar den fenotypen. I omvända genetiska screeningar introduceras däremot slumpmässiga mutationer i en målgen, följt av en undersökning av den resulterande fenotypen1^. För den omvända genetiken är mutagenes in vitro den mest använda tekniken för att skapa en pool av varianter som sedan screenas för fenotyper av intresse. Olika genetiska verktyg har rapporterats för att uppnå genomomfattande slumpmässig mutagenes av RNA-virus, inklusive felbenägen PCR (ep-PCR)^2,3, cirkulär polymerasförlängning⁴ och Mu-transposoninsättningsmutagenes 5,6,7. De två senare metoderna ger bibliotek med begränsad sekvensdiversitet och är benägna att introducera stora insättningar och raderingar, vilket är mycket dödligt för virus och allvarligt begränsar återhämtningen av infektiösa virusvarianter.

ep-PCR är en välkänd kraftfull mutagenesteknik som ofta används inom proteinteknik för att generera muterade enzymer för val av fenotyper med önskade egenskaper, såsom förbättrad termisk stabilitet, substratspecificitet och katalytisk aktivitet ^8,9,10. Denna teknik är lätt att utföra eftersom den kräver enkel utrustning, inte involverar tråkiga manipulationer, använder kommersiellt tillgängliga reagenser och är snabb; Dessutom genererar det bibliotek av hög kvalitet.

Här utvecklade vi en ny metod för fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS) för att generera kompletta genom av hepatit C-virus (HCV) genom att integrera ep-PCR, som inducerar slumpmässig genomomfattande substitutionsmutagenes och omvänd genetik. Till och med en enda nukleotidinsättning eller nukleotidradering är mycket skadlig för RNA-virus med positiv känsla ([+]ssRNA); därför är PCR-baserad substitutionsmutagenes den föredragna metoden för iterativ generering av stora, olika bibliotek av fullständiga (+)ss-RNA-virusgenom med god viabilitet.

FL-MRS är ett enkelt tillvägagångssätt som kan tillämpas på alla RNA-virus med positiv känsla med en genomlängd på ~10 kb genom genom den noggranna utformningen av en primeruppsättning som binder till den virala cDNA-klonen. pJFH1 är en infektiös cDNA-klon som kodar för HCV genotyp 2a och kan rekapitulera alla steg i virusets livscykel. Genom att använda FL-MRS-metoden demonstrerade vi syntesen av slumpmässigt mutagena helgenombibliotek (mutantbibliotek [MLs]) för att producera replikationskompetenta JFH1-varianter för vilka det inte fanns någon tidigare kunskap om de egenskaper som är associerade med mutationer. Vid exponering för ett antiviralt medel övervann några av virusvarianterna snabbt läkemedelstrycket med den önskade fenotypiska förändringen. Med hjälp av det protokoll som beskrivs här kan en uppsjö av virusvarianter genereras, vilket skapar möjligheter att studera evolutionen av (+)ssRNA-virus.

Protocol

OBS: JFH1-stammen (WT) som används här var en vänlig gåva från Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den mänskliga hepatomcellinjen, Huh7.5, var en vänlig gåva från Charles Rice, Rockefeller University. En schematisk bild av metoden visas i figur 1. 1. Genomomfattande substitutionsmutagenes av JFH1 med hjälp av felbenägen PCR För att utföra ep-PCR, förbered masterblandningen för fyra uppsättningar expe…

Representative Results

En uppsjö av HCV-varianter i full längd kan genereras och screenas för läkemedelsresistenta fenotyper av intresse enligt de procedurer som beskrivs i figur 1. Helgenommutantbibliotek syntetiserades med klonal-pJFH1 i minskande mängder (100-10 ng), som visas i figur 2. Den genomsnittliga avkastningen av ep-PCR-produkter (mutantbibliotek) varierade mellan 3,8 och 12,5 ng/μL. Figur 3 visar de virala transkripten syntetiserade fr?…

Discussion

I denna studie har vi beskrivit en enkel och snabb FL-MRS-procedur som integrerar ep-PCR¹⁸ och omvänd genetik för att syntetisera HCV-helgenombibliotek, som sedan kan användas i ett cellodlingssystem för att generera replikationskompetenta varianter för screening av läkemedelsresistenta fenotyper. Användningen av Taq DNA-polymeras med låg trohet är en förutsättning för ep-PCR som möjliggör inkorporering av substitutioner under PCR-amplifiering av ett viralt genom i full längd. Vi te…

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S