反向遗传学设计正义RNA病毒变异株
Summary
该协议描述了一种通过使用易出错的PCR和反向遗传学结合全长突变RNA合成在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法为表型选择提供了一个模型，可用于10 kb长的正义RNA病毒基因组。
Abstract
由于缺乏一种方便的方法来迭代生成不同的全长病毒变异，阻碍了RNA病毒定向进化的研究。通过整合全RNA基因组易出错的PCR和反向遗传学，可以诱导随机全基因组替换诱变。我们开发了一种使用这种技术合成不同文库的方法，以鉴定具有目标表型的病毒突变体。这种方法称为全长突变RNA合成（FL-MRS），具有以下优点：（i）能够通过高效的一步法PCR创建大型文库;（ii）通过操纵DNA聚合酶的保真度来创建具有不同遗传多样性水平的文库组的能力;（iii）创建可直接作为突变RNA合成模板的全长PCR产物;（iv）能够产生可作为非选择输入池递送至宿主细胞的RNA，以筛选所需表型的病毒突变体。我们发现，使用反向遗传学方法，FL-MRS是研究丙型肝炎病毒JFH1分离株生命周期各个阶段病毒定向进化的可靠工具。该技术似乎是利用定向进化来了解病毒基因在正义RNA病毒的发病机制和抗病毒耐药性中的适应、复制以及作用的宝贵工具。
Introduction
正向遗传筛选从感兴趣的病毒表型开始，然后通过对其基因组进行测序并将其与原始菌株的基因组进行比较，尝试鉴定导致该表型的突变。相反，在反向遗传筛选中，在靶基因中引入随机突变，然后检查产生的表型1。对于反向遗传学方法，体外诱变是最广泛使用的技术，可以创建一组变异，随后筛选感兴趣的表型。已经报道了多种遗传工具用于实现 RNA 病毒的全基因组随机诱变，包括易出错 PCR （ep-PCR）2,3、环状聚合酶延伸4 和 Mu-转座子插入诱变 5,6,7。后两种方法产生的文库具有有限的序列多样性，并且容易引入大量的插入和缺失，这对病毒是高度致命的，并严重限制了传染性病毒变异的恢复。
ep-PCR 是一种众所周知的强大诱变技术，广泛用于蛋白质工程中，以产生突变酶，用于选择具有所需特性的表型，例如增强的热稳定性、底物特异性和催化活性 8,9,10。这种技术易于执行，因为它需要简单的设备，不涉及繁琐的操作，使用市售试剂，并且速度快;此外，它还生成高质量的库。
在这里，我们开发了一种全长突变RNA合成（FL-MRS）的新方法，通过整合ep-PCR产生丙型肝炎病毒（HCV）的完整基因组，诱导随机全基因组替换诱变和反向遗传学。即使是单个核苷酸的插入或缺失，对正义RNA病毒（[+]ssRNA）也是高度有害的;因此，基于PCR的替代诱变是迭代生成具有良好活力的完整（+）ss RNA病毒基因组的大型、多样化文库的首选方法。
FL-MRS 是一种简单的方法，通过精心设计与病毒 cDNA 克隆结合的引物组，可以应用于任何基因组长度为 ~10 kb 的正义 RNA 病毒。pJFH1 是一种传染性 cDNA 克隆，编码 HCV 基因型 2a，可以概括病毒生命周期的所有步骤。通过使用 FL-MRS 方法，我们展示了随机诱变全基因组文库（突变文库 [ML]）的合成，以产生具有复制能力的 JFH1 变体，这些变体事先不知道与突变相关的特性。在暴露于抗病毒药物后，一些病毒变体迅速克服了药物压力，并发生了所需的表型变化。使用此处描述的方案，可以产生大量的病毒变体，从而为研究（+）ssRNA病毒的进化创造机会。
Protocol
注意：这里使用的JFH1菌株（WT）是国立传染病研究所Takaji Wakita的善意礼物。人类肝癌细胞系Huh7.5是洛克菲勒大学查尔斯·赖斯（Charles Rice）的一份礼物。该方法的原理图如图 1所示。 1. 使用易出错PCR的JFH1全基因组替换诱变 为了进行ep-PCR，用引物J-For 5′-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3’和J-Rev 5′-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3’（<strong class="xfig"…
Representative Results
按照 图 1 中描述的程序，可以生成大量全长 HCV 变体并筛选感兴趣的耐药表型。如图 2所示，使用克隆-pJFH1以递减量（100-10 ng）合成全基因组突变文库。ep-PCR产物（突变文库）的平均产量范围为3.8-12.5 ng/μL。 图3 显示了从克隆-pJFH1和代表性突变文库（使用50 ng克隆-pJFH1合成的ML50）合成的病毒转录本。克隆-pJFH1通过 XbaI 酶切?…
Discussion
在这项研究中，我们详细介绍了一种简单快速的 FL-MRS 程序，该程序集成了 ep-PCR18 和反向遗传学来合成 HCV 全基因组文库，然后可以在细胞培养系统中使用，以产生具有复制能力的变异，用于筛选耐药表型。使用低保真Taq DNA聚合酶是ep-PCR的先决条件，它允许在全长病毒基因组的PCR扩增过程中掺入取代物。我们测试了几种低保真 Taq DNA 聚合酶，发现 Platinum Taq DNA 聚合酶产生了 ~10 kb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究的资金支持（资助号BT/PR10906/MED/29/860/2014）由印度政府生物技术部提供。
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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Cite This Article
Soni, S., Agarwal, S., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants. J. Vis. Exp. (184), e63685, doi:10.3791/63685 (2022).