ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス
Summary
プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10 kbのポジティブセンスRNAウイルスゲノムに使用できます。
Abstract
多様な完全長ウイルス変異体を繰り返し生成するための便利な方法の欠如は、RNAウイルスの指向性進化の研究を妨げてきました。フルRNAゲノムエラーを起こしやすいPCRとリバースジェネティクスを統合することで、ランダムなゲノムワイドな置換突然変異誘発を誘導することができます。私たちは、この手法を用いて多様なライブラリを合成し、目的の表現型を持つウイルス変異体を同定する方法を開発しました。完全長変異体RNA合成(FL-MRS)と呼ばれるこの方法は、次の利点を提供します:(i)非常に効率的なワンステップエラーを起こしやすいPCRを介して大規模なライブラリを作成する能力。(ii)DNAポリメラーゼの忠実度を操作することにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を有するライブラリのグループを作成する能力。(iii)変異体RNA合成の鋳型として直接役立つことができる完全長PCR産物の作成。(iv)所望の表現型のウイルス変異体をスクリーニングするための非選択インプットプールとして宿主細胞に送達できるRNAを作製する能力。我々は、逆遺伝学アプローチを用いて、FL-MRSがC型肝炎ウイルスであるJFH1分離株のライフサイクルのすべての段階でウイルス指向性進化を研究するための信頼できるツールであることを発見しました。この手法は、ポジティブセンスRNAウイルスの病因と抗ウイルス耐性における適応、複製、およびウイルス遺伝子の役割を理解するために、指向性進化を採用するための非常に貴重なツールであるように思われます。
Introduction
フォワード遺伝子スクリーニングは、目的のウイルス表現型から始まり、そのゲノム配列を決定し、元の株と比較することで、その表現型の原因となる変異を特定しようとします。対照的に、逆遺伝子スクリーニングでは、標的遺伝子にランダムな変異を導入し、その後、結果として生じる表現型を調べます1。リバースジェネティクスアプローチでは、in vitro突然変異誘発は、その後、関心のある表現型についてスクリーニングされるバリアントのプールを作成するために最も広く使用されている手法です。RNAウイルスのゲノムワイドなランダム突然変異誘発を実現するために、エラーを起こしやすいPCR(ep-PCR)2,3、環状ポリメラーゼ伸長4、ミュートランスポゾン挿入突然変異誘発5,6,7など、さまざまな遺伝的ツールが報告されています。後者の2つの方法では、配列の多様性が限られており、大きな挿入や欠失が発生しやすく、ウイルスにとって致死性が高く、感染性ウイルス変異体の回復を著しく制限します。
ep-PCRは、熱安定性、基質特異性、触媒活性の向上など、所望の特性を持つ表現型を選択するための変異酵素を生成するために、タンパク質工学で広く使用されている有名な強力な突然変異誘発技術です8,9,10。この手法は、簡単な機器を必要とし、面倒な操作を必要とせず、市販の試薬を使用し、迅速であるため、実行が簡単です。さらに、高品質のライブラリを生成します。
本研究では、ゲノムワイドなランダム置換突然変異誘発とリバースジェネティクスを誘導するep-PCRを組み込んで、C型肝炎ウイルス(HCV)の全ゲノムを作製する完全長変異RNA合成法(FL-MRS)を開発しました。単一のヌクレオチドの挿入または欠失でさえ、ポジティブセンスRNAウイルス([+]ssRNA)にとって非常に有害です。したがって、PCRベースの置換突然変異誘発は、生存率の良いフル(+)ssRNAウイルスゲノムの大規模で多様なライブラリを繰り返し生成するための好ましい方法です。
FL-MRSは、ウイルスcDNAクローンに結合するプライマーセットの細心の注意を払った設計により、ゲノム長が~10 kbのポジティブセンスRNAウイルスに適用できる簡単なアプローチです。pJFH1は、HCV遺伝子型2aをコードする感染性cDNAクローンであり、ウイルスライフサイクルのすべてのステップを再現することができます。FL-MRSアプローチを用いて、ランダムに変異原化された全ゲノムライブラリー(変異体ライブラリー[ML])を合成し、変異に関連する特性に関する予備知識がなかった複製能力のあるJFH1変異体を作製することを実証しました。抗ウイルス薬に曝露すると、一部のウイルス変異体は、望ましい表現型の変化により、薬剤圧力を迅速に克服しました。ここで説明するプロトコルを使用すると、多数のウイルス変異体を生成することができ、(+)ssRNAウイルスの進化を研究する機会が生まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、HCV全ゲノムライブラリを合成するためにep-PCR18 とリバースジェネティクスを統合し、細胞培養システムで使用して、薬剤耐性表現型のスクリーニングのための複製可能なバリアントを生成できる、シンプルで迅速なFL-MRS手順を詳しく説明しました。低忠実度のTaq DNAポリメラーゼの使用は、完全長ウイルスゲノムのPCR増幅中に置換の取り込みを可能にするep-PCR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の資金援助(助成金番号BT/PR10906/MED/29/860/2014)は、インド政府バイオテクノロジー局によって提供されました。
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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