Visualisering af bakteriel motilitet baseret på en farvereaktion

Summary

Her præsenterer vi en protokol til påvisning af bakteriel motilitet baseret på en farvereaktion. De vigtigste fordele ved denne metode er, at den er let at evaluere og mere præcis og ikke kræver specialudstyr.

Abstract

Bakteriel motilitet er afgørende for bakteriel patogenicitet, biofilmdannelse og lægemiddelresistens. Bakteriel motilitet er afgørende for invasion og / eller spredning af mange patogene arter. Derfor er det vigtigt at detektere bakteriel motilitet. Bakterielle vækstbetingelser, såsom ilt, pH og temperatur, kan påvirke bakterievækst og ekspression af bakteriel flagella. Dette kan føre til nedsat bevægelighed eller endda tab af bevægelighed, hvilket resulterer i den unøjagtige evaluering af bakteriel motilitet. Baseret på farvereaktionen af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) ved intracellulære dehydrogenaser af levende bakterier blev TTC tilsat til traditionel halvfast agar til bakteriel motilitetsdetektion. Resultaterne viste, at denne TTC semisolid agar-metode til påvisning af bakteriel motilitet er enkel, nem at betjene og ikke involverer store og dyre instrumenter. Resultaterne viste også, at den højeste bevægelighed blev observeret i halvfast medium fremstillet med 0,3% agar. Sammenlignet med det traditionelle halvfaste medium er resultaterne lettere at evaluere og mere præcise.

Introduction

Bakteriel motilitet spiller en kritisk rolle i bakteriel patogenicitet, biofilmdannelse og lægemiddelresistens¹. Bakteriel motilitet er tæt forbundet med patogenicitet og er nødvendig for bakteriel kolonisering under tidlig infektion af værtsceller². Biofilmdannelse er tæt forbundet med bakteriel motilitet, hvor bakterier klæber til overfladen af faste medier gennem bevægelighed. Bakteriel motilitet har længe været anset for at være positivt korreleret med biofilmdannelse. En høj grad af bakteriel lægemiddelresistens på grund af biofilm kan føre til vedvarende infektioner, der er en trussel mod menneskers sundhed ^3,4,5. Derfor er det vigtigt at detektere bakteriel motilitet. Bakteriemotilitetstesten bruges hovedsageligt til at undersøge motiliteten af forskellige former for bakterier i levende tilstand, som indirekte kan bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af flagella og dermed har en vigtig rolle i identifikationen af bakterier.

Der er direkte og indirekte metoder til påvisning af bakteriel motilitet⁶. Da bakterier med flagella viser bevægelighed, er det muligt at opdage, om bakterier er bevægelige indirekte ved at detektere tilstedeværelsen eller fraværet af flagella. For eksempel er det muligt at detektere motilitet indirekte ved elektronmikroskopi og flagellær farvning for at indikere, at bakterier er bevægelige. Det er også muligt at detektere ved direkte metoder, såsom suspension drop og semisolid punkteringsmetoder.

Den halvfaste punkteringsmetode, der almindeligvis anvendes i bachelormikrobiologiske laboratorier til at detektere bakteriel motilitet, inokulerer bakterierne i punkteringen i det halvfaste agarmedium indeholdende 0,4-0,8% agar i henhold til retningen af bakterievækst. Hvis bakterierne vokser langs punkteringslinjen for at sprede sig rundt, vises skylignende (børstelignende) vækstspor, hvilket indikerer tilstedeværelsen af flagella og derfor bevægelighed. Hvis der ikke er nogen punkteringslinjevækstspor, er bakterien hverken flagelleret eller bevægelig.

Denne metode har imidlertid sine ulemper: bakterierne er farveløse og gennemsigtige, flagellæraktiviteten påvirkes af de levende bakteriers fysiologiske egenskaber og andre faktorer og koncentrationen af agar og reagensglassets lille diameter. Desuden er aerobe bakterier kun egnede til vækst på agaroverfladen, hvilket påvirker observationen af bakteriel motilitet. For at forbedre dette eksperiment blev der derfor tilsat 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (farveløs) til mediet for at etablere en mere pålidelig og intuitiv metode til bestemmelse af bakteriel motilitet end den nuværende direkte punkteringsmetode ved anvendelse af intracellulære dehydrogenaser til at katalysere dannelsen af et rødt produkt af TTC 7,8,9,10.

Protocol

1. Fremstilling af halvfast medium Traditionel halvfast agar Forbered den traditionelle halvfaste agar i henhold til bakteriemotilitetstestmedieopskriften ved hjælp af basisingredienserne11. 10 g tryptose, 15 g NaCl, 4 g agar opløses i tilstrækkeligt destilleret vand, pH-værdien justeres til 7,2 ± 0,2, og det endelige volumen fyldes op til 1.000 ml. Agaren autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter, og den hældes i 10 ml reagensglas…

Representative Results

Både standardstammer og isolerede stammer blev sammenlignet for motilitetsdetektion, og resultaterne er vist i tabel 1. På grund af fraværet af flagella voksede Staphylococcus aureus og Klebsiella pneumoniae kun langs den podede linje på både traditionelle og TTC semifaste medier. I modsætning hertil viste Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og Salmonella typhimurium vækst i alle retninger omkring den podede linje efter dyrkning i 24 timer på TTC …

Discussion

Påvisning af bakteriel motilitet ved halvfast medium-metoden påvirkes af mange faktorer^13,14. Bakterielle vækstbetingelser, såsom ilt (aerob på agaroverfladen, ikke-aerob i bunden af røret med det halvfaste medium), pH og temperatur, kan påvirke levedygtigheden af bakteriel flagella, hvilket kan føre til nedsat bevægelighed eller endda tab af bevægelighed¹⁵. Derudover kan nogle slimbakterier som deres bevægelighed påvirkes af p…

Materials

Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux