このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。ゼブラフィッシュの2つの遺伝子の発現パターンを検出することは、抗体が不足している場合に有用です。
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方法論記事
その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脊椎動物として、ゼブラフィッシュは生物学的研究で広く使用されています。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しているため、ヒトの病気のモデルとして使用できます。遺伝子機能研究は、遺伝子発現パターンの検出に基づいています。免疫組織化学はタンパク質発現をアッセイする強力な方法を提供しますが、ゼブラフィッシュの市販抗体の数が限られているため、共染色の適用が制限されます。 in situ ハイブリダイゼーションは、mRNA発現を検出するためにゼブラフィッシュ胚において広く使用されている。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。免疫組織化学および単一凍結切片のイメージングは、 in situ ハイブリダイゼーション後に実施した。このプロトコルは、最初に in situ 転写産物検出によって、次に同じセクションのタンパク質に対する免疫組織化学によって、2つの遺伝子の発現パターンを解明するのに役立ちます。
概要
ゼブラフィッシュは、発生と遺伝学の研究のための強力な脊椎動物モデルです1,2。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しており(遺伝子の70%がヒトゲノムと共有されています)、ヒトの病気のモデルとして使用できます3。ゼブラフィッシュでは、2つの遺伝子の発現パターンとそれらの空間的関係を検出することは非常に一般的です。免疫組織化学は、FITC標識抗体を適用して感染組織内の病原体を検出するために1941年に最初に使用されました4。組織切片の標的タンパク質は、最初に一次抗体で標識され、次に切片は一次抗体の宿主種免疫グロブリンに対する二次抗体で標識されます。抗体染色は、タンパク質の局在を検出するための堅牢なアプローチであり、細胞内レベルで高い光学分解能を提供します。しかし、ゼブラフィッシュでは利用可能な抗体の数は非常に限られています。最近の研究では、約112,000の抗体がマウス用に市販されていることを示しています。しかしながら、ゼブラフィッシュ5において信頼性が実証されている抗体はほとんどない。
代わりに、ゼブラフィッシュでは、in situハイブリダイゼーションが遺伝子発現パターン解析に広く適用され....
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プロトコル
すべての動物プロトコルは、南通大学の施設動物管理および使用委員会(No.S20191210-402)によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュ胚の採取
- 卵を採取する前夜に、トランスジェニックゼブラフィッシュとAB野生型ゼブラフィッシュ(Tg (foxP2:egfp-caax)X AB野生型または Tg (hb9:egfp)X AB野生型)のゼブラフィッシュのペアを飼育タンクに設置します( 材料表を参照)。斜めのプラスチック製の仕切りを使用してオスとメスを分離し、物理的なアクセスを防ぎます。翌日、真水で満たされた清潔な下部に飼育タンクの上部をはめ込み、飼育タンクの仕切りを取り外します。魚を10〜20分間交尾させ、飼育タンクの底に沈んだ後に卵を集めます。
- メチレンブルー(1 LのE3胚培地に1 mLの0.05%メチレンブルー)を含むE3胚培地( 材料表を参照)で胚を28.5°Cで培養します。
- 受精後24時間(hpf)の胚をフェニルチオ尿素(PTU、 材料表を参照)で処理して、色素形成を防ぎます。
注:実験には、性別を問わず動物が使用されます。
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結果
このプロトコルは、1つのmRNAと1つのタンパク質の発現パターンを同時に調べるために使用できます。図1に実験ワークフローを示します。5-HT2C受容体は、神経伝達物質セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)によって結合された5-HT受容体のサブタイプです。中枢神経系(CNS)に広く分布しており、食欲、気分、不安、生殖行動など、さまざまな脳機能を大幅に調節することができます13。CNSにおける5-HT2Cの発現は、foxP2ニューロンがフルオレセイン緑色蛍光タンパク質(GFP)によって標識されているトランスジェニック株Tg(foxp2:egfp-caax)によって検出されました。GFPは野生型ゼブラフィッシュでは発現せず、トランスジェニック系統でのみ発現した。RNA(5-HT2C、htr2c用プローブ、図2A)およびタンパク質(GFP、抗GFP、図2B)の発現の同時
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ディスカッション
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の共局在実験における重要なステップであるin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを提案しています。この方法は、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。in situハイブリダイゼーションおよび抗体染色をゼブラフィッシュ胚に対して行った。以前に公開されたいくつかのプロトコルとは対照的に14、15、16、免疫蛍光法および免疫組織化学法を用いてタンパク質発現を探索した。セクション17での使用が適切に検証されたゼブラフィッシュ特異的抗体はほとんどありません。以前の研究では、免疫蛍光法、免疫組織化学法、またはその場ハイブリダイゼーションの1つの手法のみが使用されていました。in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせてR.......
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開示事項
著者は、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、中国の南通科学技術財団(MS12019011)、中国の南通科学技術財団(JC2021058)、および江蘇高等教育機関の自然科学財団(21KJB180009)によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 二次抗体 | Invitrogen | A21202 | |
| 抗ジゴキシゲニン AP Fab フラグメント | ロシュ | 11093274910 | |
| 抗 GFP 抗体 | ミリポア | MAB3580 | |
| ブロッキング試薬 | ロシュ | 11096176001 | |
| ブロッキング溶液-1 | ラボで製造 | N/A | ブロッキング試薬を1X MABに溶解し、最終濃度10%(wt/vol)にします。オートクレーブして-20°で保存します。使用前にC。 |
| ブロッキング溶液-2 | で製造 | N/A | 0.1% Triton X-100、3% BSA、10% ヤギ血清 1x PBS |
| BM パープル | ロシュ | 11442074001 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | シグマ | B2064 | |
| CaCl<サブ>2シ | グマ | C5670 | |
| クエン酸バッファー | Leagene | IH0305 | |
| クエン酸 | シグマ | C2404 | |
| 組織用クライオモールド、15 mm x 15 mm x 5 mm | ヘッドバイオテクノロジー | H4566 | |
| DEPC 処理水 | サンゴンバイオテック | B501005 | |
| デジタルカメラ、蛍光顕微鏡 | ニコン | NI-SSR 931479 | |
| E3 胚培地 | で製造 | N/A | 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4 |
| ホルムアミド | Invitrogen | AM9342 | |
| ヤギ血清 | Sigma | G9023 | |
| ヘパリン ナトリウム塩 | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 & micro;g / mLヘパリンナトリウム塩、100 &g/mL リボ核酸 ジエチルアミノエタノール塩 |
| 免疫組織化学ウェットボックス | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| ロープロファイル ライカブレード | ライカ | 819 | |
| MABT (1x) | ラボ製 | N/A | 0.1 M マレイン酸、0.15 M NaCl、0.02% Tween-20、pH 7.5 |
| マレイン酸 | Σ | M0375 | |
| メタノール | J&K Scientific | 116481 | |
| メチレン ブルー | マックリン | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | ラボ製 | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzoライフサイエンス | ADI-950-233 | |
| パラホルムアルデヒド、4% | Abbexa | abx082483 | 1x PBS |
| PBST (1x) | ラボで製造 | N/A | 1x PBS プラス 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | ラボで製造 | N/A | 50% ホルムアミド、5x SSC、9.2 mM クエン酸 (pH 6.0)、0.1% Tween-20 |
| プロテイナーゼ K | ロシュ | 1092766 | |
| リボ核酸 ジエチルアミノエタノール塩 | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL チューブ | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1%Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A 1x | SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ゼブラフィッシュ | 南通大学動物実験センター | N/A |
参考文献
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology
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