कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के छोटे पैमाने पर निष्कर्षण
Summary
यहां प्रस्तुत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक किट का उपयोग करके एक या कुछ जानवरों से कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के सीधे और अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव का वर्णन है। परिणामी जीडीएनए तैयारी पीसीआर के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट है।
Abstract
एकल या कुछ कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण में कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग हैं, जिनमें जीनोटाइपिंग लाइनों, क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए पीसीआर शामिल है। सी एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए पारंपरिक प्रोटीनेज के-आधारित तरीकों में कई घंटे लगते हैं । वाणिज्यिक निष्कर्षण किट जो प्रभावी रूप से सी एलिगेंस छल्ली को तोड़ते हैं और जीनोमिक डीएनए निकालते हैं, सीमित हैं। एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने की एक आसान, तेज (~ 15 मिनट), और लागत कुशल विधि जो कक्षा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करती है, यहां बताई गई है। इस डीएनए निष्कर्षण विधि को पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए एक विश्वसनीय टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में एकल या कुछ देर से लार्वा (एल 4) या वयस्क नेमाटोड का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है। परिणामों से संकेत मिलता है कि डीएनए गुणवत्ता पीसीआर द्वारा विभिन्न आकारों के जीन लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए उपयुक्त है, जो प्रति प्रतिक्रिया एक वयस्क से जीनोमिक डीएनए के एक-पचासवें हिस्से में कमजोर पड़ने पर भी एकल या कुछ जानवरों के जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है। रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए सी एलिगेंस के एकल या एक छोटे से नमूने से डीएनए टेम्पलेट को जल्दी से उत्पादन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।
Introduction
यहां, पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए डीएनए को सुलभ बनाने के लिए कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस के लाइसिस के लिए दो संबंधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। पीसीआर एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आणविक तकनीक है जिसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है, जिसमें क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए जीनोटाइपिंग और डीएनए टुकड़ों को बढ़ाना शामिल है। छोटे (1 मिमी), मुक्त रहने वाले राउंडवर्म सी एलिगेंस जैविक अनुसंधान के लिए एक लोकप्रिय पशु प्रणाली है। एक एकल जानवर या कुछ जानवरों से उपयुक्त जीनोमिक डीएनए प्राप्त करना पीसीआर द्वारा अनुक्रम को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। देर से एल 4 लार्वा और वयस्कों में केवल ~ 1,000 दैहिक कोशिकाएं (कुछ बहु-परमाणु, पॉलीप्लोइड कोशिकाएं सहित), रोगाणु कोशिकाएं, और (यदि जानवर एक गुरुत्वाकर्षण हर्माफ्रोडाइट है) गर्भाशय1 में संतान होती है। हालांकि, इन जानवरों को एक छल्ली द्वारा संरक्षित किया जाता है जिसे जीनोमिक डीएनए2 निकालने के लिए बाधित किया जाना चाहिए। पीसीआर के लिए निमेटोड जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए मानक तरीकों में कई कदम शामिल हैं और कई घंटे लगते हैं। जानवरों को पहले कम से कम 15-45 मिनट (कुछ प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित है) 3,4,5,6 के लिए प्रोटीनेस के (-70 डिग्री सेल्सियस या नीचे) युक्त कृमि लिसिस बफर में जमे हुए हैं। यह कदम दरारें जानवरों को खोलती हैं।
ठंड के बाद, जानवरों को प्रोटीनेज के काम करने के लिए 60-65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, फिर एंजाइम को 95 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए निष्क्रिय कर दिया जाता है। प्रोटीनेज के डीएनए को नीचा दिखाने वाले न्यूक्लीज को नष्ट कर देता है। पीसीआर से पहले प्रोटीनेज के की निष्क्रियता प्रोटीनेज के को डीएनए पोलीमरेज़ को नीचा दिखाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित दो किट-आधारित प्रोटोकॉल रोजमर्रा के अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए एक ही जानवर या कुछ नेमाटोड से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए त्वरित, विश्वसनीय और लागत प्रभावी तरीके हैं। उपयोग की जाने वाली किट मूल रूप से पशु ऊतक, लार और बाल7 से डीएनए निकालने के लिए निर्माता द्वारा अनुकूलित की गई थी। यह लाइस कोशिकाओं के लिए एक मालिकाना ऊतक तैयारी समाधान और निष्कर्षण समाधान का उपयोग करता है और जीनोमिक डीएनए को सुलभ बनाता है। एक मालिकाना तटस्थीकरण समाधान तब उन घटकों को बेअसर करता है जो पीसीआर (जैसे, लवण, आयन, और एमजी2 + -बाध्यकारी अणुओं) को बाधित कर सकते हैं।
जीनोटाइपिंग करते समय, एक एकल जानवर का परीक्षण किया जा सकता है। यह निर्धारित करते समय कि क्या एक तनाव होमोजाइगस है, एक ही जानवर से छह या अधिक संतानों का परीक्षण करने से उच्च आत्मविश्वास मिलता है कि एक रेखा होमोजाइगस है या नहीं (विषमयुग्मजी माता-पिता [(1/4)6 × 100% = 0.02%] से बेतरतीब ढंग से छह होमोजाइगस उत्परिवर्ती संतान को चुनने का 0.02% मौका है)। यह विधि 1) प्रोटीनेज के विधि की तुलना में कम चरणों के साथ सरल है, और 2) टेम्पलेट तैयारी के समय को 15 मिनट तक कम कर देता है। इस काम के परिणाम दर्शाते हैं कि विकसित प्रोटोकॉल एकल या कुछ कीड़े से जीनोमिक डीएनए निकालने में मजबूती से काम करता है, जिसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है जिन्हें पीसीआर सहित अत्यधिक शुद्ध डीएनए की आवश्यकता नहीं होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सी एलिगेंस के जीनोटाइप का निर्धारण करना एक महत्वपूर्ण कदम है जबकि नए सी एलिगेंस उपभेदों को बनाने के लिए आनुवंशिक क्रॉस का प्रदर्शन करना। एक या कुछ सी एलिगेंस का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एन 2 तनाव और ई कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया कैनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से प्राप्त किए गए थे, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी 010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। ब्लम्प -1 (टीएम 548) तनाव राष्ट्रीय जैव संसाधन परियोजना, जापान से प्राप्त किया गया था। लेखक वर्मबेस को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच आर 01 जीएम 097591 द्वारा टीएलजी, टेक्सास वुमन यूनिवर्सिटी द्वारा टीएलजी को आंतरिक वित्त पोषण और टीडब्ल्यूयू के छात्र अनुसंधान केंद्र द्वारा एमएफएल में समर्थित किया गया था।
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
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