カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出
Summary
ここで提示されるのは、市販の組織キットを用いた1匹または数匹の動物からの Caenorhabditisエレガンス ゲノムDNAの単純かつ比較的迅速な単離の説明である。得られたgDNA調製物は、PCRに好適な鋳型である。
Abstract
単一または少数の Caenorhabditis elegans からのゲノムDNA抽出は、ジェノタイピングライン用のPCR、クローニング、シーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを持っています。 C. elegans からのゲノムDNA抽出のための伝統的なプロテイナーゼKベースの方法は数時間かかる。 C. elegans キューティクルを効果的に開封し、ゲノム DNA を抽出する市販の抽出キットは限られています。 C. elegans のゲノムDNAを抽出する簡単で高速(約15分)、費用対効果の高い方法が、教室や研究用途によく適していることがここで報告されています。このDNA抽出方法は、PCRを実行するための信頼性の高い鋳型を得るための出発物質として、単一または少数の後期幼虫(L4)または成虫線虫を使用するように最適化されています。この結果は、DNA品質がPCRによって異なるサイズの遺伝子標的を増幅するのに適しており、1反応あたり成人1人のゲノムDNAの50分の1に希釈しても、単一または数匹の動物のジェノタイピングを可能にすることを示している。報告されたプロトコルは、PCRベースのアプリケーション向けに、単一または少量の C. elegans サンプルからDNAテンプレートを迅速に製造するために確実に使用できます。
Introduction
ここでは、PCRベースのアプリケーションのためにDNAをアクセス可能にするために、Caenorhabditis elegansの溶解のための2つの関連するプロトコルが提示されています。PCRは、クローニングやシーケンシングのためのDNA断片のジェノタイピングや増幅など、多くの用途で使用される一般的に使用される分子技術です。小型(1mm)の自由生活型回虫C. elegansは、生物学的研究に人気のある動物システムです。単一の動物または数匹の動物から適切なゲノムDNAを得ることは、PCRによって配列を増幅するのに十分である。後期L4幼虫および成虫は、子宮内に〜1,000個の体細胞(いくつかの多核、倍数体細胞を含む)、生殖細胞、および(動物が雌雄同体である場合)子孫のみを含む1。しかしながら、これらの動物は、ゲノムDNA2を抽出するために破壊されなければならないキューティクルによって保護されている。PCR用の線虫ゲノムDNAテンプレートを調製するための標準的な方法は、複数のステップを伴い、数時間かかる。動物を最初にプロテイナーゼKを含むワーム溶解緩衝液(−70°C以下)中で少なくとも15〜45分間凍結する(いくつかのプロトコルではより長いことが推奨される)3、4、5、6。このステップは動物をひび割れさせます。
凍結後、動物をプロテイナーゼKが機能するために60〜65°Cで1時間インキュベートし、次いで酵素を95°Cで15〜30分間失活させる。 プロテイナーゼKは、DNAを分解するヌクレアーゼを破壊する。PCR前のプロテイナーゼKの不活性化は、プロテイナーゼKがDNAポリメラーゼを分解するのを防ぐために重要である。ここで説明する2つのキットベースのプロトコルは、日常の研究および教育ラボアプリケーションのために、単一の動物または少数の線虫のいずれかからゲノムDNAを抽出するための迅速で信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。使用されたキットは、もともと動物組織、唾液、および毛髪からDNAを抽出するために製造業者によって最適化されました7。独自の組織調製溶液と抽出溶液を使用して細胞を溶解し、ゲノムDNAをアクセス可能にします。その後、独自の中和溶液がPCRを阻害する可能性のある成分(塩、イオン、Mg2+結合分子など)を中和します。
ジェノタイピングの際、1匹の動物を試験することができる。株がホモ接合性かどうかを判断する場合、1匹の動物から6匹以上の子孫を試験すると、系統がホモ接合性であるかどうかの高い信頼性が得られます(ヘテロ接合性の親から6つのホモ接合型変異体子孫をランダムに摘み取る確率は0.02%です[(1/4)6 × 100% = 0.02%])。この方法は1)簡単で、プロテイナーゼK法よりも少ないステップで、および2)鋳型調製時間を15分に短縮する。この研究の結果は、開発されたプロトコルが単一または少数のワームからゲノムDNAを抽出する際に堅牢に機能し、PCRを含む高度に精製されたDNAを必要としない下流アプリケーションに確実に使用できることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegansの遺伝子型を決定することは、新しいC. elegans株を作成するための遺伝子交配を行う際の重要なステップです。単一または少数のC.エレガンスを用いたゲノムDNA抽出は、C.エレガンスのジェノタイピングにおける重要なステップである。このプロトコールは、市販のキットを用いたC. elegansからのゲノムDNA抽出を記載する。この方法は高速で、堅牢に機能…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N2株および 大腸菌 OP50細菌は、NIH研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けている Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から入手した。 blmp-1(tm548) 株は、国立生物資源プロジェクトから入手した。著者らはWormBaseに感謝している。この研究は、NIH R01GM097591からT.L.G.、テキサス女子大学からT.L.G.への内部資金提供、およびTWUの学生研究センターからM.F.L.への資金提供によって支援されました。
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
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