Småskala ekstraksjon av Caenorhabditis elegans genomisk DNA
Summary
Presentert her er en beskrivelse av den enkle og relativt raske isolasjonen av Caenorhabditis elegans genomisk DNA fra ett eller noen få dyr ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig vevssett. Det resulterende gDNA-preparatet er en passende mal for PCR.
Abstract
Genomisk DNA-ekstraksjon fra en eller noen få Caenorhabditis elegans har mange nedstrøms applikasjoner, inkludert PCR for genotyping linjer, kloning og sekvensering. De tradisjonelle proteinase K-baserte metodene for genomisk DNA-ekstraksjon fra C. elegans tar flere timer. Kommersielle ekstraksjonssett som effektivt bryter opp C. elegans kutikal og ekstrakt genomisk DNA er begrenset. En enkel, raskere (~ 15 min) og kostnadseffektiv metode for å trekke ut C. elegans genomisk DNA som fungerer bra for klasserom og forskningsapplikasjoner rapporteres her. Denne DNA-ekstraksjonsmetoden er optimalisert for å bruke enkelt eller noen få senlarv (L4) eller voksne nematoder som startmateriale for å oppnå en pålitelig mal for å utføre PCR. Resultatene indikerer at DNA-kvaliteten er egnet for å forsterke genmål av forskjellige størrelser av PCR, slik at genotyping av enkelt eller noen få dyr selv ved fortynning til en femtiendedel av det genomiske DNA fra en enkelt voksen per reaksjon. De rapporterte protokollene kan brukes pålitelig til raskt å produsere DNA-mal fra en enkelt eller en liten prøve av C. elegans for PCR-baserte applikasjoner.
Introduction
Her presenteres to relaterte protokoller for lysis av Caenorhabditis elegans for å gjøre DNA tilgjengelig for PCR-baserte applikasjoner. PCR er en vanlig brukt molekylær teknikk som brukes til mange bruksområder, inkludert genotyping og forsterkning av DNA-fragmenter for kloning og sekvensering, blant andre. Den lille (1 mm), frittlevende rundorm C. elegans er et populært dyresystem for biologisk forskning. Å skaffe passende genomisk DNA fra et enkelt dyr eller noen få dyr er tilstrekkelig til å forsterke sekvensen av PCR. Sen L4 larver og voksne inneholder bare ~ 1000 somatiske celler (inkludert noen multi-nukleære, polyploide celler), kimceller, og (hvis dyret er en gravid hermafroditt) avkom i utero1. Imidlertid er disse dyrene beskyttet av en kutikel som må forstyrres for å trekke ut det genomiske DNA2. Standardmetoder for å forberede nematode genomisk DNA-mal for PCR innebærer flere trinn og tar flere timer. Dyrene fryses først i ormelysbuffer som inneholder proteinase K (−70 °C eller lavere) i minst 15-45 min (lengre anbefales av noen protokoller)3,4,5,6. Dette trinnet sprekker åpne dyrene.
Etter frysing inkuberes dyrene i 1 time ved 60-65 °C for at proteinase K skal fungere, da aktiveres enzymet i 15-30 min ved 95 °C. Proteinase K ødelegger kjernene som forringer DNA. Inaktivering av proteinase K før PCR er viktig for å forhindre at proteinase K nedbryter DNA-polymerasen. De to kit-baserte protokollene som er beskrevet her er raske, pålitelige og kostnadseffektive metoder for å trekke ut genomisk DNA fra enten et enkelt dyr eller noen få nematoder for daglig forskning og undervisning i laboratorieapplikasjoner. Settet som ble brukt ble opprinnelig optimalisert av produsenten for å trekke ut DNA fra dyrevev, spytt og hår7. Den bruker en proprietær vevsforberedelsesløsning og ekstraksjonsløsning for å lyse celler og gjøre genomisk DNA tilgjengelig. En proprietær nøytraliseringsløsning nøytraliserer deretter komponentene som kan hemme PCR (f.eks. salter, ioner og Mg2+-bindende molekyler).
Ved genotyping kan et enkelt dyr testes. Når du bestemmer om en stamme er homozygot, gir testing av seks eller flere avkom fra et enkelt dyr høy tillit til at en linje er homozygot eller ikke (det er 0,02% sjanse for tilfeldig å plukke seks homozygot mutantavkom fra en heterozygot forelder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denne metoden 1) er grei, med færre trinn enn proteinase K-metoden, og 2) reduserer malforberedelsestiden til 15 min. Resultatene i dette arbeidet viser at den utviklede protokollen fungerer robust for å trekke ut genomisk DNA fra en eller noen få ormer, som på en pålitelig måte kan brukes til nedstrøms applikasjoner som ikke krever svært renset DNA, inkludert PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å bestemme genotypene til C. elegans er et viktig skritt mens du utfører genetiske kryss for å skape nye C. elegans stammer. Genomisk DNA-ekstraksjon ved hjelp av en enkelt eller få C. elegans er et avgjørende skritt i genotyping C. elegans. Denne protokollen beskriver genomisk DNA-ekstraksjon fra C. elegans ved hjelp av et kommersielt sett. Denne metoden er rask og fungerer robust. Det genomiske DNA-et som ekstraheres ved hjelp av denne metoden, kan brukes til nedstrøms…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N2-stammen og E. coli OP50-bakteriene ble hentet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Blmp-1(tm548)- stammen ble hentet fra National Bioresource Project, Japan. Forfatterne takker WormBase. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01GM097591 til T.L.G., intern finansiering av Texas Woman’s University til T.L.G, og TWUs Center for Student Research til M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
