Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het darmslijmvlies is een complexe fysieke en biochemische barrière die een groot aantal belangrijke functies vervult. Het maakt het transport, de absorptie en het metabolisme van voedingsstoffen en xenobiotica mogelijk, terwijl het een symbiotische relatie met microbiota vergemakkelijkt en de invasie van micro-organismen beperkt. Functionele interactie tussen verschillende celtypen en hun fysieke en biochemische omgeving is van vitaal belang om de homeostase van darmweefsel tot stand te brengen en te behouden. Het modelleren van deze complexe interacties en geïntegreerde darmfysiologie in vitro is een formidabel doel met het potentieel om de manier waarop nieuwe therapeutische doelen en kandidaat-geneesmiddelen worden ontdekt en ontwikkeld te transformeren.
Organoïden en Organ-on-a-Chip-technologieën zijn onlangs gecombineerd om voor de mens relevante darmchips te genereren die geschikt zijn voor het bestuderen van de functionele aspecten van darmfysiologie en pathofysiologie in vitro. Organoïden afgeleid van de biopten van de kleine (twaalfvingerige darm) en dikke darm worden gezaaid in het bovenste compartiment van een orgaanchip en breiden vervolgens met succes uit als monolagen met behoud van de verschillende cellulaire, moleculaire en functionele kenmerken van elk darmgebied. Menselijke darmweefselspecifieke microvasculaire endotheelcellen worden opgenomen in het onderste compartiment van de orgaanchip om de epitheliaal-endotheelinterface te recreëren. Dit nieuwe platform vergemakkelijkt luminale blootstelling aan voedingsstoffen, geneesmiddelen en micro-organismen, waardoor studies van darmtransport, permeabiliteit en gastheer-microbe-interacties mogelijk worden.
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de oprichting van darmchips die de menselijke twaalfvingerige darm (twaalfvingerige darmchip) en dikke darm (colonchip) vertegenwoordigen, en hun daaropvolgende cultuur onder continue stroom en peristaltiekachtige vervormingen. We demonstreren methoden voor het beoordelen van medicijnmetabolisme en CYP3A4-inductie in duodeenchip met behulp van prototypische inductoren en substraten. Ten slotte bieden we een stapsgewijze procedure voor de in vitro modellering van interferon gamma (IFNγ) -gemedieerde barrièreverstoring (leaky gut syndrome) in een darmchip, inclusief methoden voor het evalueren van de verandering van paracellulaire permeabiliteit, veranderingen in cytokinesecretie en transcriptomische profilering van de cellen in de chip.
Inleiding
De menselijke darm is een complex en multitaskend orgaan dat in staat is tot zelfregeneratie. Het is verdeeld in de dunne en dikke darm. De primaire functie van de dunne darm is om voedsel uit de maag verder te verteren, alle voedingsstoffen te absorberen en het residu door te geven aan de dikke darm, die het water en de elektrolyten terugwint. De dunne darm is verder verdeeld in meerdere anatomisch verschillende regio's: de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum, die elk zijn aangepast om specifieke functies uit te voeren. De twaalfvingerige darm helpt bijvoorbeeld bij het afbreken van de chyme (maaginhoud) om de juiste opname van voedingsstoffen met eiwitten, koolhy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle celculturen moeten worden behandeld met behulp van een juiste aseptische techniek.
De menselijke darmorganoïden die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van de Johns Hopkins University en alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde richtlijnen en voorschriften. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Bereiding van de celkweekreagentia
- Bereid het menselijke organoïde groeimedium voor volgens de instructies van de fabrikant (tabel met mat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1D vat de tijdlijn van de darmchipcultuur samen en illustreert de intestinale endotheelcellen en organoïden voor en bij het zaaien op de chip. Bovendien toont het de duidelijke morfologische verschillen tussen de twaalfvingerige darm en de darmchips, benadrukt door de aanwezigheid van de villi-achtige formaties in de twaalfvingerige darmchip en representatief voor de dunne darmarchitectuur.
Figuur 3A,B toont de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De combinatie van organ-on-a-chip-technologie en intestinale organoïden is veelbelovend voor nauwkeurige modellering van menselijke darmfysiologie en pathofysiologie. Hier bieden we een eenvoudig en robuust stapsgewijs protocol (beschreven in figuur 1) voor het vaststellen van de darmchip met biopsie-afgeleid klein darm- of colonepitheel en intestinale microvasculaire endotheelcellen die samen worden gekweekt in een microfluïdisch apparaat. Deze chipgebaseerde simulatie van de menselijke dar.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi en Magdalena Kasendra zijn huidige of voormalige werknemers van Emulate Inc. en kunnen aandelen bezitten. Emulate Inc. is het bedrijf dat de orgaanchipapparaten produceert en patenten heeft gepubliceerd die relevant zijn voor het werk dat in dit artikel wordt vermeld.
Dankbetuigingen
We bedanken professor Mark Donowitz voor het leveren van de van darmbiopsie afgeleide organoïden en Brett Clair voor het ontwerpen van de wetenschappelijke illustraties van de chip-, draagbare en kweekmodule. Alle andere wetenschappelijke illustraties zijn gegenereerd met behulp van de BioRender.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | - | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | - | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | - | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | - | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | - | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | - | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | - | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | - |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | - | - | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | - | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | - | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel - Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 33919 |
Referenties
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
