Vi presenterer en protokoll for implementering av interferensrefleksjonsmikroskopi og total-intern-refleksjon-fluorescensmikroskopi for samtidig avbildning av dynamiske mikrotubuler og fluorescerende merkede mikrotubule-assosierte proteiner.
Flere teknikker har blitt brukt for direkte visualisering av cytoskeletale filamenter og deres tilknyttede proteiner. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) mikroskopi har et høyt signal-til-bakgrunn-forhold, men det lider av fotobleaching og fotodamage av fluorescerende proteiner. Etikettfrie teknikker som interferensrefleksjonsmikroskopi (IRM) og interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT) omgår problemet med fotobleaching, men kan ikke lett visualisere enkeltmolekyler. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å kombinere IRM med et kommersielt TIRF-mikroskop for samtidig avbildning av mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer) og dynamiske mikrotubuler in vitro. Denne protokollen muliggjør høyhastighetsobservasjon av MAPer som samhandler med dynamiske mikrotubuler. Dette forbedrer eksisterende tofargede TIRF-oppsett ved å eliminere både behovet for mikrotubul merking og behovet for flere ekstra optiske komponenter, for eksempel en ekstra eksitasjonslaser. Begge kanalene er avbildet på samme kamerabrikke for å unngå problemer med bilderegistrering og bildesynkronisering. Dette oppsettet demonstreres ved å visualisere enkeltkinesinmolekyler som går på dynamiske mikrotubuler.
Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) mikroskopi brukes vanligvis til visualisering av enkelt fluorescerende molekyler. Sammenlignet med epifluorescence-avbildning oppnår TIRF overlegen bakgrunnsundertrykking, noe som muliggjør lokalisering og sporing av enkeltfluoforer med høy oppløsning. Av denne grunn er TIRF den foretrukne metoden for å visualisere fluorescerende merket mikrotubule-assosierte proteiner og brukes ofte til å avbilde mikrotubuler 1,2.
For å undersøke reguleringen av mikrotubuledynamikk av MAPer, er det ofte nødvendig å avbilde både mikrotubuler og MAPer samtidig. De fleste eksisterende metoder for dette formålet er dyre eller lider av tekniske ulemper. Samtidig tofarget TIRF krever for eksempel to eksitasjonslasere og to kameraer. I tillegg til den høye prisen, utgjør behovet for separate kameraer rammesynkronisering og bilderegistreringsproblemer. Dette behovet kan omgås hvis en roterende filterkube brukes til fysisk å bytte mellom eksitasjonslasere i påfølgende rammer3. I et slikt oppsett kan en enkelt kamerabrikke brukes, og rammene veksler mellom bilder av mikrotubuler og MAPer. Denne teknikken er imidlertid begrenset av hastigheten på filterendringen, som vanligvis begrenser bildefrekvensen til mindre enn 0,5 bilder per sekund3 (fps). En slik bildefrekvens er utilstrekkelig til å løse raske dynamiske prosesser, for eksempel krymping av en mikrotubule som forekommer med en hastighet på opptil 500 nm / s, vandring av kinesin med en hastighet på størrelse med 800 nm / s, eller diffusjonen av et MAP som forekommer med diffusjonskoeffisienter over 0,3 μm2 / s4. Dette er spesielt problematisk når du sporer de relative posisjonene til to bevegelige mål i hver kanal, for eksempel posisjonen til et MAP i forhold til posisjonen til en bevegelig mikrotubulspiss5.
I tillegg til disse optiske begrensningene krever tofarget TIRF-mikroskopi at MAPer og mikrotubuler merkes med forskjellige fluoroforer hvis utslippsspektra er tilstrekkelig separert. Fluorescerende merking av tubulin kan endre mikrotubuldynamikk6, og fotobleaching av fluoroforer begrenser bildehastigheten7. På grunn av disse problemene er etikettfrie avbildningsteknikker utviklet for å visualisere mikrotubuler. Disse inkluderer interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)8,9, roterende-sammenhengende spredningsmikroskopi (ROCS)10, mikroskopi for romlig lysinterferens (SLIM)11 og interferensrefleksjonsmikroskopi (IRM)12,13. Disse teknikkene tillater rask etikettfri avbildning av mikrotubuler uten ulemper ved fluorescensavbildning, men de kan ikke brukes til å visualisere enkle MAPer.
Av disse etikettfrie teknikkene skiller IRM seg ut for sine lave kostnader og beskjedne krav til instrumentering. Vi har nylig presentert en protokoll for å kombinere IRM med et kommersielt TIRF-mikroskop, slik at mikrotubuler og fluorescerende MAPer kan avbildes i vekslende rammer 3,13. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å endre dette oppsettet for samtidig å ta TIRF- og IRM-bilder samtidig på én enkelt kamerabrikke. Dette innebærer å legge til en billig strålesplitter i eksitasjonsbanen for samtidig å belyse prøven med en TIRF-laser og en IRM LED-lyskilde. En modifisert kommersiell bildesplitter brukes til å skille TIRF- og IRM-signalene og projisere dem på separate halvdeler av samme kamerabrikke. Vi bruker også et mikrofluidisk system som tillater rask utveksling av reagenser under avbildning. Denne protokollen beskriver hvordan dette oppsettet kan brukes til å avbildning av dynamiske mikrotubuler og MAPer. Apparatets evne demonstreres ved å presentere den første visualiseringen av kinesin-1 proteiner som går på krympende mikrotubuler, som fanges med en bildefrekvens på 10 s-1.
Å studere regulering av mikrotubuledynamikk ved mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer) krever ofte samtidig avbildning av mikrotubuler og MAPer. Fluorescensmikroskopiteknikker som TIRF brukes vanligvis til dette formålet. Imidlertid er de begrenset av ulempene ved fluorescensavbildning, som inkluderer fotobleaching, fotodamage og behovet for fluoroformerking. Etikettfrie metoder, for eksempel IRM, er egnet for visualisering av mikrotubuler, men er ikke i stand til å avbilde enkle fluoroforer. Denne protokollen kombinerer etikettfri IRM-avbildning og TIRF-mikroskopi for samtidig avbildning av dynamiske mikrotubuler og MAPer.
IRM-oppsettet bruker en LED-belysningskilde filtrert til >600 nm, mens TIRF-oppsettet bruker en 488 nm laser. Vi brukte en billig platestrålesplitter for å reflektere belysningslyset på prøven og overføre det oppsamlede signalet til detektoren (figur 1). En strålesplitter med 10% refleks og 90% overføring ble valgt for å minimere tapet av enkeltmolekylsignalet. 90% tap i belysningslysintensiteten kompenseres ved å øke kraften til belysningslaseren og LED-lampen.
Spektral separasjon av signalene ble oppnådd ved hjelp av en 90/10 (R / T) stråle splitter og to spektralfiltre (langpass 600 nm for IRM og båndpass 535/50 nm for TIRF). De spektralt separerte IRM- og TIRF-signalene projiseres på to halvdeler av en enkelt kamerabrikke ved hjelp av en bildesplitterenhet. Bruken av en 90/10 strålesplitter ofrer 90% av IRM-signalet, men dette kompenseres ved å øke intensiteten til LED-belysningskilden. Et dikroisk speil kan også brukes her for å skille IRM- og TIRF-signalene mer effektivt. Fluorescerende mikrober som er inkludert i analysene muliggjør nøyaktig justering av TIRF- og IRM-bildene og fungerer som en referanse for å fokusere målet.
Det mest kritiske optiske elementet i denne protokollen er det høye målet for numerisk blenderåpning (NA). Dette er viktig ikke bare for å oppnå total intern refleksjon, men også for å maksimere innsamlingseffektiviteten og bildekontrasten. Kvaliteten på de oppnådde bildene avhenger også av rensligheten av glassoverflaten og oppkjøpet av et klart bakgrunnsbilde for å korrigere for ikke-enhetlig belysning og fjerne statiske funksjoner. For IRM-avbildning anbefaler vi at du bruker langbølgelengdebelysning (>600 nm) for å minimere fotodamasje av mikrotubuler og proteiner. Dette er spesielt viktig hvis en hvit LED-lyskilde brukes, i så fall bør et langpassfilter inkluderes for å fjerne UV-lys.
Denne protokollen muliggjør etikettfri, høyhastighetsavbildning av dynamiske mikrotubuler og samtidig høyoppløselig visualisering av fluorescerende MAPer17. Sammenlignet med filterkubevekslingsteknikken, som veksler mellom å ta bilder av mikrotubuler og MAPer, er dette oppsettet i stand til mye høyere bildefrekvens fordi det ikke avhenger av den fysiske rotasjonen av en filterkube. Sammenlignet med tofargede TIRF-avbildningsteknikker, bruker denne teknikken et mindre krevende optisk oppsett og omgår behovet for fluoroformerking av mikrotubuler. De viktigste begrensningene i dette oppsettet skyldes TIRF-avbildningen av MAPene; bildefrekvensen er begrenset av eksponeringstiden til en fluorofor, og fotobleaching av fluoroforer er fortsatt en mulighet. Ikke desto mindre forbedrer denne protokollen eksisterende teknikker fordi den bare bruker TIRF når det er nødvendig (dvs. for å visualisere MAPer, men ikke mikrotubuler) og oppnår høyest mulig hastighet innenfor TIRFs grenser. Ytterligere forbedringer er bare mulig hvis både mikrotubulene og MAP-ene visualiseres via en interferometrisk teknikk, men dette krever merking av MAPer med metallnanopartikler, som har sine begrensninger og eksperimentelle utfordringer.
For å demonstrere evnene til denne teknikken visualiserte vi samtidig to raske dynamiske prosesser via IRM og TIRF: krympingen av en mikrotubule og vandringen av et fluorescerende kinesinmolekyl. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å visualisere rask diffusjon av spastin på krympende mikrotubuler5. Utover denne applikasjonen til MAPs og mikrotubuler, kan denne protokollen brukes til å visualisere enkle fluorescerende molekyler samtidig med enhver makromolekylær struktur som er massiv nok til å visualiseres via IRM, for eksempel en cellemembran eller aktinfilament.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Thierry Emonets laboratorium for å dele renromsutstyr. Vi takker Yin-Wei Kuo for å ha forberedt den rensede eGFP-kinesinen som ble brukt i denne studien. Y.T. anerkjenner støtten fra Alexander von Humboldt Foundation gjennom Feodor Lynen Research Fellowship. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01 GM139337 (til J.H.).
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |