Lysindusert in situ transmisjonselektronmikroskopi for observasjon av interaksjonen mellom væske og myk materie

Summary

Denne protokollen beskriver transmisjonselektronmikroskop (TEM) modifikasjoner med et lysbelysningssystem, fabrikasjon av flytende celler og in situ TEM-observasjoner av lysinduserte interaksjoner mellom bakterieceller og en fotosensibilisator. Prøveprepareringsmetodene, elektronstråleskader og avbildning diskuteres også.

Abstract

Den nåværende protokollen beskriver modifikasjonene av transmisjonselektronmikroskopet (TEM) oppsett for in situ lysinduserte observasjoner. Et glass optisk fiber satt inn i elektronkolonnen over objektivlinsens polstykke, og en laser, en justerbar lyskilde, ble brukt til å fremstille enheten. Etter at belysningen er kalibrert ved hjelp av et eksternt målesystem, tillater det en å justere intensiteten av belysningen til behovene til den observerte prosessen. Dette belysningssystemet ble brukt til å avbilde antimikrobielle fotodynamiske terapifenomener, som for tiden er gjenstand for intens forskning. Prøven ble fremstilt ved å oppdage en suspensjon av bakterier på et karbon-, grafen- eller silisiumnitridsubstrat, blotting av overflødig løsning, spotting av fotosensibiliseringsløsningen, blotting av overflødig væske igjen og deretter montering av væskecellen med et andre substrat eller grafenfilm. Prosessen med selve bildeeksperimentet inkluderer å velge riktig sted for observasjon ved bruk av lav forstørrelse og en minimumsdose elektroner, og deretter syklisk aktivering av lyskilden for å ta påfølgende bilder med angitte intervaller med den minste mengden elektroner som er nødvendig. Elektrondosen av hver eksponering og tiden og intensiteten av belysningen som brukes, må registreres nøye på grunn av kompleksiteten til de observerte fenomenene, samtidig som prosessen er både lys- og elektrondrevet. Etter at selve eksperimentet er utført, må det gjøres ytterligere kontrollobservasjoner, der de samme dosene elektroner brukes, men uten ekstra lyspåvirkning og mindre doser elektroner brukes til høyere doser lys. Dette gjør det mulig å skille lysinduserte mikrostrukturelle effekter fra de som er forårsaket av elektroner innen både livs- og materialvitenskap.

Introduction

Lysinduserte fenomener i høy oppløsning er interessante på mange felt som nanoengineering 1,2,3, katalyse ^4,5 og biofotonikk⁶. Noen originale design som tillater slike eksperimenter, finnes i litteraturen, inkludert modifikasjoner av prøveholderne 1,4,7,8,9 og den optiske fiberen festet til mikroskopet ^10,11.

Kombinasjonen av lysbelysning, et flytende miljø og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gir en flott mulighet for detaljerte, dynamiske studier av fotoinduserte prosesser. Imidlertid er høyvakuumtilstanden inne i mikroskopet ganske ugunstig for mange væsker, spesielt vannløsninger. Flytende innkapsling, som beskytter den mot miljøet, kan oppnås ved hjelp av noen få teknikker basert hovedsakelig på grafen¹², silisiumnitrid¹³ eller karbon¹⁴ substrater. I tillegg til forskning innen materialvitenskap², gir såkalte flytende celler muligheter for å gjennomføre ukonvensjonelle mikroskopiske observasjoner på biologiske prøver nær deres opprinnelige forhold¹⁵. Slike observasjoner er ekstremt krevende, spesielt for levende mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som ioniserende stråling forårsaker irreversibel skade på de hydrerte prøvene, så elektrondosen må spesifiseres¹⁶. Dette er nødvendig for å minimere ugunstige effekter, kontrollere skaden og unngå forvirrende gjenstander. Den optimale maksimale elektrondosen som tillater observasjoner av levende celler er fortsatt et tvilsomt tema¹⁶, men dosen på 30 e⁻/nm² ser ut til å være grenseverdien, i hvert fall for bakterier¹⁷.

Noen av fagene av interesse for slike mikroskopiske studier er prosesser under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)¹⁸. Kort sagt, terapien fortsetter som følger. Bakteriecellene er omgitt av den lysfølsomme væsken kalt fotosensibilisator. Når lysbelysning gis ved en bestemt bølgelengde, genereres de cytotoksiske reaktive oksygenartene (ROS) fra energi eller ladningsoverføring fra de eksiterte fotosensibilisatormolekylene til oksygenet som er naturlig tilstede i løsningen. Patogener utsatt for ROS blir raskt inaktivert med svært høy effektivitet, uten bivirkninger¹⁹. Responsen på terapien varierer for forskjellige mikrober – for eksempel kan virkningen av samme fotosensibilisator være ganske forskjellig for Gram-positive og Gram-negative bakterier²⁰. Generelt har det blitt fastslått at hovedmålet for ROS er de ytre strukturer av celler, hvor skade resulterer i funksjonsforstyrrelser i cellemembranen og dermed fører til bakteriedød^21,22. Imidlertid kan skade på nukleinsyrer og proteiner også betraktes som en årsak til inaktivering¹⁸, så det er fortsatt ukjent hvilke cellestrukturer som er hovedmålene under denne prosessen¹⁹. En dypere forståelse av de skadelige prosessene kan bidra til å forbedre denne definitive terapien. Sammenlignet med lysmikroskopimetodene som brukes i APDT-forskning²³, gir TEM-teknikker flere muligheter til å se på APDT-mekanismen med høyere oppløsning og forstørrelse²⁴. TEM har allerede blitt brukt til celleobservasjon under pågående behandling, noe som tillot oss å studere Gram-positive bakterieskader og beskrive endringene som forekommer i celleveggen i detalj ^6,25.

Den nåværende protokollen presenterer et egnet eksperimentelt oppsett for høyoppløselig avbildning av lysindusert bakterieinaktivering ved bruk av TEM, som krever et riktig lysbelysningssystem, innkapsling av celler med væske og streng elektrondosekontroll. Bakteriene som ble brukt til observasjonen var Staphylococcus aureus, og en metylenblå løsning ble brukt som fotosensibilisator. Det spesielle lysbelysningsoppsettet består av en justerbar halvlederlaser koblet direkte til mikroskopkolonnen ved hjelp av lysfiberen. Denne utformingen gir jevn bestråling gjennom hele prøven på grunn av den nesten parallelle plasseringen av den optiske fiberen til mikroskopaksen. Monokromatisk lys med høy intensitet generert av laseren kan deretter brukes til å studere ulike fotokjemiske effekter. Lyset som ble brukt i forsøket hadde en bølgelengde lik 660 nm fordi metylenblått i det synlige området har absorpsjonstopper ved 613 nm og 664 nm²⁶. Protokollen for flytende innkapsling er basert på karbonsubstrater, noe som gjør prosedyren rask og ukomplisert. Til slutt presenteres en metode for lavdose in situ TEM-observasjon av celler i væske. Vanskelighetene med prøvepreparering, elektrondoseeffekter på det følsomme prøven og rimelig bildetolkning diskuteres.

Protocol

1. Transmisjonselektronmikroskopmodifisering Endre transmisjonselektronmikroskopet ved å koble den optiske fiberen (se materialtabellen) til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillat noen få centimeter mellomrom mellom objektivlinsen og kondensatorlinsen, pluss et gratis spor for tilbehør.MERK: En dedikert prøveholder4 eller en holder for katodoluminescerende observasjoner i omvendt konfigurasjon1 kan også bruk…

Representative Results

Det eksperimentelle oppsettet ble designet for å observere de lysinduserte prosessene som forekommer i en væske med høy oppløsning. Konkurranseanalysen av bildene tillot oss å skille skaden forårsaket av elektronstrålen fra endringer relatert til den fotokjemiske reaksjonen. Effekten av elektronstrålen på den følsomme prøven (i dette tilfellet cellene innkapslet med væske) var synlig over hele det bestrålte området da elektronene trengte jevnt gjennom det. Selvfølgelig avhenger effekten av elektrondosen, s…

Discussion

Installasjon og igangkjøring av belysningen krever grunnleggende servicekunnskap og kan skade mikroskopet. Den enkleste måten å introdusere lyset til mikroskopet er å koble den optiske fiberen fra toppen av objektivlinsen, der det vanligvis er plass til TEM-avbøyningsspolene og ekstra detektorer. Mer ledig plass kan også forventes fra eldre toppinngangsenheter, der samme sted huser prøvevakuumlåsen og prøveinstallasjonsmekanismen. Denne konfigurasjonen er mye beskrevet i en tidligere rapport^25<…

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum