Summary
Her beskriver vi en metode for å generere glioblastom (GBM) organoider fra primære pasientprøver eller pasientavledede cellekulturer og opprettholde dem til modenhet. Disse GBM-organoidene inneholder fenotypisk forskjellige cellepopulasjoner og gjenskaper tumormikromiljøer ex vivo.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den hyppigst forekommende primære maligne hjernekreftformen med ekstremt dårlig prognose. Intratumoralt cellulært og molekylært mangfold, samt komplekse interaksjoner mellom tumormikromiljøer, kan gjøre det vanskelig å finne effektive behandlinger. Tradisjonelle tilhenger- eller sfærekulturmetoder kan maskere slike kompleksiteter, mens tredimensjonal organoidkultur kan rekapitulere regionale mikromiljøgradienter. Organoider er en metode for tredimensjonal GBM-kultur som bedre etterligner pasienttumorarkitektur, inneholder fenotypisk forskjellige cellepopulasjoner, og kan brukes til eksperimenter med middels gjennomstrømning. Selv om tredimensjonal organoidkultur er mer arbeidskrevende og tidkrevende sammenlignet med tradisjonell kultur, gir den unike fordeler og kan tjene til å bygge bro over gapet mellom nåværende in vitro og in vivo systemer. Organoider har etablert seg som uvurderlige verktøy i arsenalet til kreftbiologer for bedre å forstå tumoradferd og resistensmekanismer, og deres applikasjoner fortsetter bare å vokse. Her er det gitt detaljer om metoder for generering og vedlikehold av GBM-organoider. Instruksjoner om hvordan man utfører organoidprøveinnbygging og seksjonering ved hjelp av både frosne og parafininnbyggingsteknikker, samt anbefalinger for immunhistokjemi og immunfluorescensprotokoller på organoidseksjoner, og måling av total organoid celle levedyktighet, er også beskrevet.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den hyppigst forekommende primære hjernesvulsten med en dyster prognose på ca. 15 måneder fra diagnose1. Behandlinger som er effektive i prekliniske studier kan ofte være dårlig effektive hos pasienter 2,3. Dårlig klinisk respons tilskrives mange faktorer, inkludert mikromiljømessig heterogenitet av GBM og komplekse intratumorale interaksjoner. Disse kan være vanskelige å gjenskape i laboratoriemiljøet med tradisjonelle tilhenger- eller kulekulturmetoder4. Tilstedeværelsen av en undergruppe av selvfornyende kreftstamceller (CSC) innenfor GBM kan også bidra til denne kompleksiteten 5,6. CSC er avgjørende for tumorutbredelse og opprettholder tumorvekst ved å fremme aktiv angiogenese, kreftinvasjon og motstand mot terapier, inkludert stråling 7,8,9. CSC er ikke jevnt fordelt gjennom svulster, men er beriket innenfor spesifikke mikromiljøer, inkludert perivaskulær nisje og perinekrotiske regioner, som hver gir distinkt molekylær regulering av deres cellulære tilstander 10,11,12,13,14. CSC-er er ikke passive mottakere av mikromiljøsignaler, men har i stedet muligheten til å ombygge sine egne mikromiljøer 7,15,16. Mikromiljøet til en CSC kan fremme vedlikehold av stamcelletilstand som svar på press som næringsmangel, pH og hypoksi17,18,19,20, noe som tyder på viktigheten av disse forholdene i et modellsystem. Rekapitulering av det mangfoldige cellulære mikromiljøet i svulster er derfor avgjørende for å forstå terapeutisk motstand og identifisere nye terapier.
Tredimensjonal kultur har økt i popularitet de siste årene21,22. Organoider har blitt brukt i andre typer kreft, og det primære målet med å opprettholde celler som organoider er å tillate vekst av heterogene cellepopulasjoner (hvorav mange normalt kan utkonkurreres i mer homogen sfærekultur) og romlig mangfold, sett på som regionale tumormikromiljøer med genetisk spesifisitet 4,23,24,25,26 . Det finnes mange metoder for tredimensjonal kultur av kreftceller, som hver har fordeler og ulemper27,28,29. Organoidkultur er ikke ment å være en erstatning for tradisjonell tilhenger- eller sfærekultur. Det brukes best som en komplementær teknikk til todimensjonale metoder når det er spesifikke spørsmål der samspillet mellom cellemikromiljø og tumorcelleresponser er kritisk.
Denne artikkelen beskriver pålitelige og repeterbare metoder for å generere GBM-organoider fra enten primære pasientprøver eller pasientavledede kulturer. Vi tar for oss to ulike mål for tredimensjonal organoidkultur: (1) etablering av organoider fra primærpasientvev, med maksimalt transplanteringspotensial uavhengig av ensartethet, eller (2) dyrking av ensartede organoider for mer kvantitativ eksperimentell bruk. Når du etablerer en primærprøve som organoider, er det ikke nødvendig å filtrere for enkeltceller eller telle celler, fordi det er en prioritet å holde maksimale celletall og typer for å etablere den opprinnelige kulturen. Ved dyrking av organoider for komparative eksperimenter er det imidlertid nødvendig med enkeltcellefiltrering og celletelling for å sikre at replikasjonsorganoider er sammenlignbare for eksperimentell konsistens. Denne protokollen beskriver hvordan man etablerer organoidkulturer og skaper ensartede organoider, samt raffinerte metoder for innebygging og bevaring av organoider og standard cellekultureksperimenter, inkludert immunhistokjemi, immunfluorescens og vurdering av total celle levedyktighet i GBM-organoider.
Protocol
Alle trinnene i protokollen (e) beskrevet nedenfor ble utviklet og gjennomført i samsvar med Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) protokoll # 2559 og Institutional Biosafety Committee (IBC) godkjenning # 1711. Sfærer og organoider dyrkes i "Neurobasal Media Complete" (NBMc). Se tabell 1 for instruksjoner.
1. Å lage organoidformer
- Ta vokspapiret av parafilmarket (omtrent 4 cm x 4 cm i størrelse) og legg det mellom to sterile 96-brønns polymerasekjedereaksjonsplater (PCR).
- Utfør disse trinnene i kulturhetten og vær spesielt forsiktig med å holde "innsiden" av parafilmen (siden som dekkes av papiret) ren. Denne rene siden skal gjøre konkavitet av innrykkene.
- Påfør jevnt trykk på den øverste 96-brønns PCR-platen for å danne små dimples i parafilmen. Målet er at smilehullene skal være omtrent 2 mm dype uten å lage hull i parafilmen.
- Skill de to 96-brønns PCR-platene forsiktig. Den dimpled parafilmen vil holde seg til topplaten. Legg dette på tørris i ca 30 s.
- Etter at parafilmen har vært på tørris i 30 s, bruk sterile tang for å trekke parafilmen av den øverste 96-brønns PCR-platen.
- Når du fjerner parafilmen, bruk en rask bevegelse i stedet for å være veldig "forsiktig". Frossen parafilm er lettere å fjerne enn oppvarmet parafilm, noe som kan føre til at smilehullene inverteres.
- Plasser den ferdige parafilmformen i en dekket, steril 10 cm cellekulturskål. Former kan lages på forhånd og lagres hvis steriliteten opprettholdes.
2. Makrodisseksjon av pasientens vevsprøve
- I en steril kulturskål (10 cm cellekulturplater), bruk to sterile barberblad for å finhakke pasientprøven mens du påfører jevnt trykk.
MERK: Hakking av prøven er enklest med ca 500 μL NBMc på kulturskålen. Forsøk med barberblad å hakke biter så fint som mulig; Ideelt sett er individuelle brikker 1 mm3 eller mindre. - Overfør de finhakkede tumorbitene til et 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en kuttet p1000 pipettespiss.
MERK: Når du håndterer organoider, er det viktig å bare bruke kuttede pipettespisser på p1000. Disse kan kuttes med en skarp barberhøvel til ønsket åpningsstørrelse (mellom 5 og 8 mm omtrent) og autoklaveres. - Tilsett 2 ml romtemperatur (RT) celleløsning (materialtabell) og legg den i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i ca. 10 min.
MERK: Observer og bland med noen minutters mellomrom. Noen celleoppløsningsløsninger eller prøver kan trenge varierende inkubasjonstider. Hvis klumping oppstår, noe som kan indikere DNA-frigjøring på grunn av cellelyse, fortsett til neste trinn umiddelbart. - Tilsett 8 ml NBMc-medier for å nøytralisere celleoppløsningen, og spinn i 3 minutter ved 65 x g.
- Aspirer supernatanten og resuspender vevet i 1-2 ml NBMc.
3. Generere organoider fra primær pasientvev
MERK: Målet når man lager organoider fra primærpasientvev er å etablere tredimensjonal kultur. Ikke filtrer etter enkeltceller eller tell celler, men hold den første cellebelastningen så jevn som mulig ved hjelp av visuell inspeksjon. Det er normalt å ha heterogenitet i vekst og etablering av innledende organoider. Hver organoid vil være 20 μL i volum (16 μL lamininrik ekstracellulær matriks (lrECM) og 4 μL vev suspendert i NBMc, fra trinn 2.5). Instruksjoner kan justeres for antall organoider beregnet; Målet er å typisk danne rundt 20-30 organoider fra primære pasientprøver.
- I en isbøtte eller kuldeblokk, plasser lrECM og et lite sentrifugerør. Plasser riktig mengde lrECM (16 μL x X antall tiltenkte organoider) i det lille sentrifugerøret.
- Tilsett passende volum vevssuspensjon fra trinn 2,5 (4 μL x antall tiltenkte organoider) til sentrifugerøret på is.
- Pipetter forsiktig 20 μL av lrECM/cellesuspensjonsblandingen på parafilmformer; Dette vil danne en perlelignende dråpe.
- Sørg for å blande blandingen av lrECM/cellesuspensjon grundig. cellene har en tendens til å bosette seg lett i lrECM, noe som resulterer i heterogene organoider.
- Hold lrECM/cellesuspensjonsblandingen på is. Hvis lrECM varmer, kan den polymerisere og kompromittere organoiddannelse. Sørg for å avkjøle pipettespissen annenhver til tredje organoider for å forhindre lrECM-polymerisering. Ikke introduser luftbobler i organoider (unngå å "dobbelttrykke" pipetten).
- Når ønsket antall organoider er pipettert på parafilmform i en 10 cm cellekulturplate, dekk med platelokk og inkuber ved i en cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 i1-2 timer.
- Etter at organoidene har størknet, bruk NBMc-medier til å skylle dem forsiktig av parafilmformen og inn i en ny, steril 10 cm kulturplate med 20 ml NBMc totalt. Å bruke en p1000-spiss fungerer best for å skylle organoidene av formen; de vil gli forsiktig av.
MERK: Når organoider skylles fra formene inn i cellekulturplater, bør de være synlige i media som små rosa kuler. Hvis organoidene ser ut til å ha falt fra hverandre eller knust i media, indikerer dette et tidligere problem med at lrECM har polymerisert, og organoider kan fortsatt vokse, men vil være svært lite sannsynlig å være ensartede i størrelse. - Plasser 10 cm kulturskålen i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 (uten risting) i 4 dager.
MERK: Plassering av organoider på en orbital shaker i de første dagene kan føre til at de faller fra hverandre. Pass på at de ikke rister før dag 4. - Etter 4 dager, bytt media og legg på en orbital shaker ved 80 RPM i en cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Utveksling av medier med umodne organoider er utfordrende fordi de er vanskelige å visualisere. Vipp cellekulturskålen og vent i minst 20 s; organoidene vil slå seg ned i bunnen og la media ovenfra fjernes med et glass eller plast 10-20 ml pipette sakte.
- Vær nøye med samlingen av organoider nederst; Hvis de ser ut til å være opphisset av kraften i fjerning av media, er det best å stoppe opp og la dem bosette seg. Etter hvert som organoider modnes og er lettere å visualisere, blir denne prosessen mindre nyansert.
MERK: Noen ganger kan plassering av et stykke mørkt papir under cellekulturplaten bidra til å visualisere umodne organoider. Det anbefales ikke å bruke en Pasteur-pipette med vakuumsug for å fjerne medier, da det er veldig enkelt for organoider å bli sugd opp og tapt på denne måten. - Når organoider først er etablert, bruker de ikke media så raskt som modne organoider. Fra og med 50% medieutveksling reduseres unødvendig mediebruk og reduserer sjansen for utilsiktet skade eller aspirering av nye organoider under medieutvekslingsprosessen.
4. Generere organoider fra etablert GBM-sfære, tilhenger eller organoidkultur
MERK: Målet her er å lage organoider som er ensartede i størrelse og cellemengde for bruk i komparative eksperimenter, så bruk et enkeltcellefilter og telle celler for å sikre dette.
- Forbereder enkeltcellesuspensjon fra GBM-sfærekultur.
MERK: Sfærekulturer av GBM-celler opprettholdes i NBMc-medier.- Plasser kuler i et 15 ml sentrifugerør og spinn ved 120 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og tilsett 2 ml RT-celleoppløsning. Plasser i en 37 ° C inkubator i 3 min.
- Tilsett 8 ml NBMc-medier for å nøytralisere celleoppløsningen. Stram gjennom en enkelt cellesil (70 μm) og spinn i 5 minutter ved 120 x g.
- Fjern supernatanten fra røret og resuspender de gjenværende cellene i ~ 1 ml NBMc. Tell cellene (ved hjelp av celle impermeant flekk) og gå til trinn 4.4.
- Forbereder enkeltcellesuspensjon fra GBM-adherentekultur.
- Fjern det brukte mediet fra platen, tilsett 2 ml RT-celleoppløsningsløsning på platen, og sett i en 37 ° C inkubator i 3 minutter.
- Bekreft under mikroskopet at cellene er løsrevet fra platen.
- Tilsett 8 ml NBMc-medier for å nøytralisere celleoppløsning. Stamme gjennom en encellet sil (70 μm).
MERK: Enkeltcellebelastning er valgfritt når du arbeider med tilhengerkultur. - Spinn i 5 minutter ved 120 x g. Fjern supernatanten fra røret og resuspender de gjenværende cellene i ~ 1 ml NBMc. Tell cellene (ved hjelp av celle impermeant flekk) og gå til trinn 4.4.
- Forbereder enkeltcellesuspensjon fra GBM-organoidkultur.
- Overfør organoidene med en kuttet pipettespiss på p1000 til en 10 cm kulturplate og fjern forsiktig så mye restmedier som mulig.
- Bruk to sterile barberhøvler, hakk forsiktig organoider fint. Med den kuttede p1000-spissen, flytt hakkede organoider til et 15 ml sentrifugerør og tilsett ~ 2-3 ml NBMc-medier.
- Spinn ved 120 x g i 3 minutter og fjern supernatanten (anbefaler å bruke en pipettespiss i stedet for vakuumsug for denne delen).
- Tilsett 2 ml kaldcelleløsning i 10 minutter.
MERK: Celleoppløsningen skal brukes direkte fra 4 °C, ikke varmes opp først. Dette ser ut til å myke opp eventuelle gjenværende matrigel og hjelpemidler i cellegjenoppretting. - Flytt deretter til en 37 ° C inkubator i 10-20 min, observere og blande hvert par minutter. Hvis klumping vises, noe som kan indikere cellelyse, fortsett til neste trinn umiddelbart.
- Tilsett 8 ml NBMc-medier for å fortynne celleoppløsningen. Sil gjennom en encellet sil (70 μm) og spinn i 5 minutter ved 120 x g.
- Fjern supernatanten fra røret og resuspender de gjenværende cellene i ~ 1 ml NBMc. Tell cellene (ved hjelp av celle impermeant flekk) og fortsett til trinn 4.4.
- Å lage organoider fra en encellet suspensjon
- I en isbøtte eller kuldeblokk, plasser lrECM og et lite sentrifugerør. Plasser riktig mengde lrECM (16 μL x X antall tiltenkte organoider) i det lille sentrifugerøret.
- Lag en blanding av celler i et totalt volum (4 μL x X antall tiltenkte organoider) som vil inneholde 20.000 celler / organoid og legg dette til det lille sentrifugerøret med lrECM på is.
- Pipetter forsiktig 20 μL av lrECM/cellesuspensjonsblandingen på parafilmformer; Dette vil danne en perlelignende dråpe.
- Sørg for å blande blandingen av lrECM/cellesuspensjon grundig, da cellene har en tendens til å legge seg lett i lrECM, og dette vil resultere i heterogene organoider.
- Hold lrECM/cellesuspensjonsblandingen på is. Hvis lrECM varmer, kan den polymerisere og kompromittere organoiddannelse.
- Sørg for å avkjøle pipettespissen annenhver til tredje organoider for å forhindre lrECM-polymerisering. Ikke introduser luftbobler i organoider (unngå å "dobbelttrykke" pipettespissen).
- Når ønsket antall organoider er pipettert på parafilmform i en 10 cm kulturplate, inkuber ved 37 ° C i 1-2 timer i en cellekulturinkubator.
- Etter at organoider har størknet, bruk NBMc-medier til å skylle dem forsiktig av parafilmformen og inn i en ny, steril 10 cm kulturplate med 20 ml NBMc totalt. Bruk av en p1000-spiss fungerer best for å skylle organoider av formen; de vil gli forsiktig av.
MERK: Omtrent 15-20 organoider per 10 cm kulturskål anbefales. - Plasser 10 cm kulturskålen i en inkubator (uten risting) i 4 dager.
- Etter 4 dager, bytt media og legg på en orbital shaker ved 80 RPM i cellekulturinkubatoren. Utveksle medier hver 2-3 dag etterpå.
- Utveksling av medier med umodne organoider er utfordrende fordi de er vanskelige å visualisere. Vipp cellekulturskålen og vent i minst 20 s; Organoidene vil slå seg ned i bunnen og la media ovenfra fjernes med en stor åpningsglasspipette sakte.
- Vær nøye med samlingen av organoider nederst; Hvis de ser ut til å være opphisset av kraften i fjerning av media, ta en pause og la dem komme tilbake. Etter hvert som organoider modnes og er lettere å visualisere, blir denne prosessen mindre nyansert.
MERK: Noen ganger kan plassering av et stykke mørkt papir under cellekulturplaten bidra til å visualisere umodne organoider. Ikke bruk en Pasteur-pipette med vakuumsug for å fjerne medier, da det er veldig enkelt for organoidene å bli sugd opp og tapt på denne måten. - Når organoider først er etablert, bruker de ikke media så raskt som modne organoider. Begynn med 50% medieutveksling for å redusere unødvendig mediebruk og redusere sjansen for å skade eller aspirere nye organoider ved et uhell under medieutvekslingsprosessen.
5. Kryoembedding
- Plasser hver organoid i et individuelt 1,5 ml rør (ved bruk av kuttet p1000 spiss) som inneholder 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Oppbevar organoider over natten ved 4 °C. Hvis organoider legges inn i parafin, går du videre til avsnitt 6.
- Etter nattfiksering i 4% PFA, vask organoidene i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) tre ganger.
- Overfør organoiden til et nytt 1,5 ml rør (ved bruk kuttet p1000 pipettespiss) som inneholder 1 ml 30 % sukrose i vann og oppbevares ved 4 °C over natten.
- Tilsett en liten mengde (typisk 1-2 ml) optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) til et kryomm, som dekker bunnen og fyller ca. 1/3 til 1/2 av dybden av formen.
- Overfør en enkelt organoid til cryomold ved hjelp av kuttet p1000 pipettespiss. Dette vil resultere i at noen medier overføres med organoiden, noe som er uunngåelig. Bruk en mindre pipettespiss til å fjerne omgivende medier forsiktig uten å forstyrre organoiden.
MERK: Dette kan være vanskelig å visualisere, men langsom pipettering vil demonstrere en klar forskjell i tetthet mellom media og OCT, så dette gjøres "av følelse" til en viss grad). - Legg kryommet på et brett med tørris. OCT vil begynne å fryse, bli ugjennomsiktig i prosessen.
- Tilsett ekstra OCT for å dekke organoiden helt, og fyll resten av volumet av kryomet. Blokker kan lagres ved -20 °C for korttidslagring i flere dager eller ved -80 °C for langtidslagring på ubestemt tid.
6. Paraffin innebygging
- Sorter organoider etter størrelse (små organoider er under 3 mm, store organoider er over 3 mm). Overfør hver organoid til en histologkassett ved hjelp av en kuttet pipettespiss på p1000 og bearbeid til parafinvoks i henhold til enten tabell 2 eller tabell 3.
MERK: Størrelsen / konfigurasjonen av histologikassetten er opp til brukeren. - Overfør organoider fra kassettene til innebygging av former med 1-2 ml smeltet parafinvoks og avkjøl den til voksen er halvsolid.
- Når voksen er delvis størknet, tilsett mer voks på toppen av formen. Legg den merkede kassetttoppen over formen og overfør denne til en kaldplate. Fortsett å avkjøle til voksen er helt fast.
- Når voksen har størknet, del blokken ved hjelp av en mikrotom. Alternativt kan du oppbevare ved RT eller 4 °C for senere seksjonering.
7. Immunfluorescens (IF)
- De-paraffinisere og rehydrere 5-12 μm parafin-innebygde vevsseksjoner ved hjelp av en lysbildefargingsfat, i henhold til følgende trinn.
MERK: Hvis du bruker seksjoner fra OCT-innebygde organoider, anbefaler vi at du bruker 12 μm-seksjoner. Fjern OCT ved å riste lysbildet i PBS i 30 min. Gå til trinn 7.2.- Inkuber i 5 minutter i xylen. Gjenta dette to ganger til. Deretter ruges i 10 minutter i 100% etanol. Gjenta dette en gang til.
- Inkuber i 10 minutter i 95% etanol. Gjenta en gang til. Vask seksjonene i destillert vann i 5 min, to ganger.
- For antigenmaskering, senk lysbildene i 1x citrate unmasking løsning (Table of Materials) og mikrobølgeovn ved sub-kokende temperatur i 10 min. Pass på at du ikke lar løsningen koke.
MERK: Dette oppnås best hvis det først dyrkes i mikrobølgeovn i ~ 2 minutter til koking oppstår, deretter senker kraften og ser på for å sikre at løsningen ikke koker over. Den foretrukne avmaskeringstemperaturen er like under 100 °C, ideelt 98 °C. - La lysbildene avkjøles i 30 minutter ved RT i 1x citrate unmasking solution.
MERK: Dette er den samme 1x citrate-løsningen; Løsningen trenger ikke byttes ut på dette trinnet. - Vask skliene i destillert vann i 5 min, to ganger.
- Vask lysbildene i 1x TBST (Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20) buffer i 5 min.
- Fjern lysbildene fra TBST og tørk dem forsiktig rundt vevsseksjoner ved hjelp av en laboratorierengjøringsserviett mens du er forsiktig så du ikke lar vevsseksjonen tørke. Når lysbildet er tilstrekkelig tørt, sirkler vevsseksjoner med en hydrofob barrierepenn.
- Blokker hver seksjon med 100-400 μL 10% serumblokkerende oppløsning i 1 time ved RT. Velg serumblokkeringsløsningen basert på det sekundære antistoffet. For eksempel, hvis du bruker et sekundært antistoff laget i esel, bruk et 10% normalt eselserum i 1x TBST.
- Fjern blokkeringsløsningen og tilsett deretter 100-400 μL primært antistoff fortynnet til ønsket konsentrasjon i blokkeringsløsningen.
- Ved 4 °C, inkuberer seksjonene med det primære antistoffet over natten.
- Fjern den primære antistoffløsningen og vask lysbildene i 1x TBST i 5 minutter, tre ganger.
- Tilsett 100-400 μL sekundært antistoff (1:1000 fortynning i blokkeringsløsning, eller i henhold til produsentens anvisninger) til hver seksjon og inkuber i 1,5 timer ved RT.
- Vask lysbildene i 1x TBST i 5 min, to ganger. Vask deretter lysbildene i 1x PBS i 5 minutter.
- Fjern lysbildene fra PBS og tørk dem rundt vevsseksjoner ved hjelp av en laboratorierengjøringsserviett. Tilsett noen dråper flytende herdingsfeste og monter et glassdeksel forsiktig. Når lysbildene er tørre, oppbevares ved -20 °C beskyttet mot lys til de er klare for avbildning.
8. Immunhistokjemi
- De-paraffinisere og rehydrere parafin-innebygde vevsseksjoner ved hjelp av en lysbildefargingsfat, i henhold til følgende trinn.
MERK: Hvis du bruker seksjoner fra OCT-innebygde organoider, fjern OCT ved å riste lysbildet i PBS i 30 minutter. Gå til trinn 8.2.- Inkuber i 5 minutter i xylen. Gjenta to ganger til.
- Inkuber i 10 minutter i 100% etanol. Gjenta en gang til.
- Inkuber i 10 minutter i 95% etanol. Gjenta en gang til.
- Vask seksjoner i destillert vann i 5 min, to ganger.
- For antigenavmaskering, senk lysbildene i 1x citrate unmasking løsning og mikrobølgeovn ved sub-kokende temperatur i 10 min. Pass på at du ikke lar løsningen koke.
- La lysbildene avkjøles i 30 minutter ved RT i 1x citrate unmasking solution.
- Vask skliene i 5 minutter i destillert vann, tre ganger.
- Inkuber lysbildene i 10 minutter i 3% hydrogenperoksid.
- Vask skliene i 5 minutter i destillert vann to ganger.
- Vask lysbildene i 5 minutter i 1x TBST.
- Fjern lysbildene fra 1x TBST, og bruk deretter hjørnet på en laboratorierengjøringsserviett til å tørke forsiktig rundt vevsseksjoner.
- Sirkle vevsseksjonene med en hydrofob barrierepenn når lysbildet er tørt.
- Plasser 100-400 μL av blokkeringsløsningen på hver seksjon innenfor den hydrofobe barrierepennsirkelen ved RT i 1 time. Bruk enten 10 % normalt eselserum (NDS) eller 0,75 % bovint serumalbumin (BSA) fortynnet i 1x TBST.
- Fjern deretter blokkeringsløsningen og tilsett 100-400 μL av det primære antistoffet til hver seksjon. Fortynn dette primære antistoffet til ønsket konsentrasjon ved bruk av riktig produsents fortynningsmiddel.
- Inkuber seksjonene ved 4 °C over natten. Fjern den primære antistoffløsningen og vask lysbildene i 1x TBST i 5 minutter, tre ganger.
- Tilsett 100-400 μL IHC-deteksjonsreagens til hver seksjon og inkuber i 1 time ved RT. Velg IHC-deteksjonsreagenset i henhold til det primære antistoffet.
- Vask hver seksjon med 1x TBST i 5 min, to ganger, etterfulgt av 1x PBS i 5 minutter en gang.
- Forbered 3,3-Diaminobenzidin (DAB) løsning i henhold til produsentens anvisninger. Tilsett 100-400 μL DAB-oppløsning til hver vevsseksjon og overvåk nøye under et mikroskop. Mellom 1-10 min vil gi akseptabel fargeintensitet; Sørg for å merke deg denne gangen og hold deg konsekvent for alle vevsseksjoner.
- Etter at ønsket fargeintensitet er nådd, senk lysbildene i destillert vann.
- Utfør hematoxylin counterstain og slide dehydrering for montering i henhold til instruksjonene i tabell 4.
- Fjern lysbildet fra xylenerstatningen (materialfortegnelse) og tørk av ekstra væske rundt vevsdelen ved hjelp av en rengjøringsserviett for laboratoriet. Bruk en liten mengde permanent monteringsmedium for å montere dekselet over vevsseksjonen og la det tørke.
9. Måling av total celle levedyktighet
- Overfør hver organoid til et 2 ml rør, og fjern forsiktig alle overflødige medier rundt organoiden ved hjelp av en liten pipettespiss (se figur 3 for skjematisk av denne prosedyren).
MERK: Cell levedyktighet analyser må utføres med organoider som ble gjort med identisk antall celler. Dette eksperimentet bør ikke utføres på organoider laget direkte fra pasientprøver fra kirurgi, fra kutting av alredyformede organoider eller andre tilfeller der enkeltceller ikke ble filtrert og talt. - Forbered den selvlysende cellens levedyktighetsanalysereagens og 1x PBS i forholdet 1: 1 og tilsett 500 μL til hvert rør.
- Bruk en pipettespiss på p1000 til å pipette aggressivt opp og ned for å bryte ned organoiden og la den virke i 5 min. Organoiden skal være noe dissosiert og mykere nå; Gjenta blandingen med pipettespissen på P1000 igjen.
- Målet er å ha 100 μL totalvolum per brønn av en 96-brønns plate. Tilsett 25 μL av blandingen fra trinn 9.3 (vil ha nok til flere tekniske replikasjoner) og tilsett 75 μL gjenværende luminescerende celle levedyktighetsanalyse og PBS-blanding.
- Legg tallerkenen på en shaker i 2 minutter og inkuber deretter i 20 minutter ved RT.
- Les platen ved hjelp av en luminescensinnstilling på en plateleser og samle inn dataene (se figur 4).
Representative Results
Figur 1 viser tidlig organoidvekst sett via lysmikroskopi ved 10x forstørrelse. Figur 1A viser migrasjon og invasjon av enkeltceller gjennom lrECM i midtvisningen. Cellene vil fortsette å ekspandere og "kolonisere" lrECM, og de vil virke tettere og til slutt ugjennomsiktige ved visuell inspeksjon. Figur 1B viser flere modne organoider (ved 7 uker) uten forstørrelse, i forhold til størrelsen på en krone.
Figur 2 viser immunhistokjemisk farging av GBM-organoider for fosfohiston H3, en markør for aktiv proliferasjon. De fleste svært proliferative celler ses i organoidperimeteren sammenlignet med organoidkjernen. Positiv farging vil ha et brunt / kobberutseende.
Figur 3 beskriver prosessen for å homogenisere og måle totalt celletall i GBM-organoider ved hjelp av en 3D-spesifikk luminescerende celle levedyktighetsanalyse. På grunn av det høye antallet celler som er tilstede i GBM-organoider, blir den større organoidstrukturen opprinnelig homogenisert ved triturering i luminescerende analysereagens. Deretter lastes fraksjoner av det totale organoidlysatet i individuelle brønner og fortynnes med ytterligere luminescerende analysereagens før inkubering og lesing på en passende flerbrønnsplateleser.
Figur 4 representerer DMSO (common vehicle) kontrolldata for organoider. Plottede data viser intraorganoid og interorganoid konsistens. Selvlysende levedyktighetsdata vil vanligvis bli normalisert til kontroller for hvert eksemplar når eksperimentelle data genereres.
Figur 1: Utsikt gjennom et lysmikroskop (10x). (A) Tidlig organoidvekst som demonstrerer migrasjon / invasjon av GBM-celler gjennom den lamininrike ekstracellulære matrisen. (B) Modne organoider i forhold til størrelsen på en krone. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunhistokjemi av GBM-organoider. (A, B) GBM-organoider som viser fosfohiston H3-fargede celler for aktiv proliferasjon. Scalebars er 600 μm og 300 μm for henholdsvis A og B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Selvlysende celle levedyktighetsprotokoll for organoider. (A) Flytt individuelle organoider til små sentrifugerør og fjern overflødig media. (B) Tilsett 500 μL av 1: 1 PBS og selvlysende celle levedyktighetsanalyseblanding til hvert rør og pipette aggressivt for å bryte ned organoiden. (C) Tilsett 25 μL av denne organoidblandingen og 75 μL av samme 1: 1 PBS og luminescerende celle levedyktighetsanalyseblanding til hver brønn av en 96-brønnplate. (D) Plasser på en shaker i 2 min, etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved RT, og les deretter luminescens på en plateleser. Figur laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cellens levedyktighet. Cellens levedyktighetsdata for organoider i 0,1% dimetylsulfoksid (DMSO) for seks tekniske replikasjoner av fire organoider for fire pasientprøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Kvantitet |
| Nevrobasalt medium minus fenolrødt | 500 ml |
| B-27 tilskudd minus vitamin A (50x) | 10 ml |
| Antibiotisk-antimykotisk (100x) | 5 ml |
| Natriumpyruvat (100 mM) | 5 ml |
| Glutamin i 0,85% NaCl (200 mM) | 5 ml |
| Rekombinant human FGF basisk (250 μg/ml) | 20 μL |
| Rekombinant humant EFG-protein (250 μg/ml) | 20 μL |
| Fenol rød | 500 μL |
Tabell 1: Neurobasal medium komplett (NBMc) formulering
| Reagent | Tid |
| 50% etanol | 3 minutter |
| 75% etanol | 3 minutter |
| 95% etanol | 3 minutter |
| 95% etanol | 4 minutter |
| 100% etanol | 2 minutter |
| 100% etanol | 3 minutter |
| 100% etanol | 4 minutter |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
| Xylen erstatning | 3 minutter |
| Xylen erstatning | 4 minutter |
| Parafinvoks | 15 minutter |
| Parafinvoks | 15 minutter |
Tabell 2: Behandlingsplan for små organoider (under 3 mm i diameter)
| Reagent | Tid |
| 50% etanol | 6 minutter |
| 75% etanol | 6 minutter |
| 95% etanol | 5 minutter |
| 95% etanol | 8 minutter |
| 100% etanol | 5 minutter |
| 100% etanol | 5 minutter |
| 100% etanol | 8 minutter |
| Xylen erstatning | 5 minutter |
| Xylen erstatning | 5 minutter |
| Xylen erstatning | 8 minutter |
| Parafinvoks | 30 minutter |
| Parafinvoks | 30 minutter |
Tabell 3: Behandlingsplan for store organoider (over 3 mm i diameter)
| Reagent | Tid |
| Hematoksylin | 2 minutter |
| Kjører diH2O | 2 minutter |
| Nukleær hematoksylinklarerende reagens | 1 min |
| Kjører diH2O | 1 min |
| Bluing Reagens | 1 min |
| Kjører diH2O | 2 minutter |
| 70% etanol | 1 min |
| 100% etanol | 1 min |
| 100% etanol | 1 min |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
| Xylen erstatning | 2 minutter |
Tabell 4: Hematoksylin counterstain
Discussion
GBM-organoider er en komplementær kulturmetode til tradisjonelle sfærer som inkluderer større cellulær og mikromiljømessig heterogenitet 4,22,30. Selv om det er mer tid og ressurskrevende, kan organoidkultur gi verdifull innsikt i intratumoral oppførsel og mekanismer for stoffresistens.
GBM er drevet av en befolkning på CSCs 5,31, og disse metodene ble utviklet for å tillate fortsatt vekst og selvfornyelse av denne CSC-befolkningen. Epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF) er kjent for å forbedre stamcelle vedlikehold og vekst og gi aktiv reseptor tyrosinkinase (RTK) signalering. Dannelsen av heterogene cellulære populasjoner og distinkte tumormikromiljøer i GBM-svulster er avhengig av å støtte CSC-atferd. Valget av en lrECM etterligner det lamininrike hjernemiljøet og støtter cellene i organoidkulturen til selvorganisering og migrering ved invasjon. Selv om noen grupper har etablert organoidkultur uten bruk av en lrECM eller EGF / FGF-beriket media24,28, som kan tilby en mer tidseffektiv måte av denne kulturmetoden og sterkere utvalg av onkogen signalering for å drive vekst, ble disse metodene valgt for å optimalisere pro-stamcellemiljøet for best å etablere den cellulære heterogeniteten til organoider. Både cerebrale organoider og GBM-organoider er laget med lrECM i litteraturen tidligere 21,32,33. Selv om vi har etablert data om tumorpopulasjonene som finnes i organoider og den romlige variasjonen, er mindre kjent om ikke-tumorpopulasjoner i organoider og hvor lenge de overlever fra de opprinnelige pasientprøvene. Visse IHC-flekker (for eksempel CD45) kan gi disse dataene, og kan være et interessant forskningspunkt i fremtiden med organoider.
Å vite den tiltenkte bruken for organoidkultur er viktig for å velge passende metoder. Etablering av organoider fra primære prøver versus voksende ensartede organoider for spesifikke eksperimenter har litt forskjellige prosedyrer. Å ha en forståelse for hvordan organoider modnes og visuelt fyller ut lrECM-stillaset er viktig for å kunne tildele riktig tid og ressurser til organoidkultur. Sparsomme områder av celler i organoider vil sakte utvide og vokse for å fylle lrECM, som kan ta alt fra 2-8 uker, avhengig av prøvens oppførsel. Denne veksthastigheten er noe iboende for hvert eksemplar; Den er bevart på tvers av forskjellige grupper av organoider og ganske konsistent med den relative frekvensen av sfærevekst. Organoider kan opprettholdes i over 1 år og beholde tumordannelsesevner på xenograft til mus; Det anbefales imidlertid å dyrke dem med et tydelig formål for ikke å kaste bort laboratorieressurser (både materialer og tid)4. Organoidvekst er testet i flere brønnstørrelser og formater, og viser at en 10 cm plate er den ideelle innstillingen for å opprettholde optimal celle levedyktighet, etterfulgt av en 6-brønns plate med tre organoider per brønn34. Organoider bruker mer media sammenlignet med sine todimensjonale kulturmodeller, og bruk av et mindre brønnformat fører ikke til riktig vedlikehold. For eksempel har en brønn av en 96-brønns formatplate ikke nok plass eller medievolum i forhold til størrelsen på en organoid for å opprettholde organoidvekst.
Som organoider etablerer, er det viktig å være observant for å øke suksessen. I utgangspunktet vil organoider konsumere media sakte, men etter hvert som de blir tettere og mer modne, vil de konsumere media raskere. Tilsetning av fenolrødt til mediet kan bidra til å tjene som en indikator på medieforbruk. Når mediet er mer gult, kan det be oss om å justere fôringsmønsteret, enten det er å bytte et høyere volum av medier, øke den totale mediemengden i platen, dele organoider blant flere cellekulturplater for å holde tritt med veksten, eller til og med justere tidslinjen for eksperimenter.
På mange måter er organoider en ineffektiv måte å drive kreftforskning på. De involverer lange tidsskalaer, og er dyre og ressurstunge sammenlignet med GBM-sfærekultur. Men sammenlignet med pasientavledede xenotransplantater, en alternativ metode for å gjenskape cellulært og mikromiljømessig mangfold, er de enklere, billigere og kontrollerbare. Valg av når organoider best skal brukes er viktig for kreftforskere. De er ikke ment å erstatte tradisjonell sfære eller tilhengerkultur og ikke å erstatte xenograftmodeller. Organoider kan, når de brukes på riktig vitenskapelig spørsmål, kombinere fordelene med begge disse systemene og kan tillate oss å observere tumorcellebiologi som ellers ville forbli skjult. Det vitenskapelige samfunnet begynner bare å forstå hvilke læringsmuligheter organoider tilbyr, men det er klart at de vil være et uvurderlig verktøy i fremtiden for å forstå GBMs komplekse biologi.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Justin Lathia for hans uvurderlige råd og løpende støtte. Vi takker også Katrina Fife, Lisa Wallace og Maya Camhi for deres utmerkede tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
| 96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
| B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
| Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
| Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
| Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
| Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
| Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
| Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
| Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
| Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
| Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
| Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
| Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
| Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
| SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
| SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
| SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
| Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
| Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
| Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
- Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
- Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
- Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
- Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
- Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
- Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
- Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
- Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
- Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).
- Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).
- Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).
