La membrane basale est essentielle à la morphogenèse des tissus et des organes pendant le développement. Pour mieux comprendre les mécanismes conduisant à un placement correct de cette structure, le protocole présenté décrit des méthodes pour visualiser et caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale dans les cellules épithéliales en utilisant la microscopie confocale et super-résolution.
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Article de méthode
Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
La membrane basale (BM) - une feuille spécialisée de matrice extracellulaire présente du côté basal des cellules épithéliales - est essentielle à l’établissement et au maintien de la morphologie des tissus épithéliaux et de la morphogenèse des organes. De plus, le BM est essentiel pour la modélisation des tissus, servant de plate-forme de signalisation et fournissant des forces externes pour façonner les tissus et les organes. Malgré les nombreux rôles importants que joue le BM au cours du développement normal et des conditions pathologiques, les voies biologiques contrôlant le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la façon dont la sécrétion basale conduit au dépôt polarisé de protéines BM sont mal comprises. L’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile est un excellent système modèle pour étudier le dépôt basal des protéines membranaires BM, car il produit et sécrète tous les principaux composants du BM. L’imagerie confocale et super-résolution combinée au traitement d’images dans des tissus fixes permet l’identification et la caractérisation des facteurs cellulaires spécifiquement impliqués dans le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM. Cet article présente un protocole détaillé pour la coloration et l’imagerie des vésicules contenant du BM et du BM déposé à l’aide de protéines marquées de manière endogène dans l’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile . Ce protocole peut être appliqué pour répondre à des questions qualitatives et quantitatives et il a été développé pour permettre un criblage à haut débit, permettant l’identification rapide et efficace des facteurs impliqués dans le trafic intracellulaire polarisé et la sécrétion de vésicules pendant le développement du tissu épithélial.
Introduction
La membrane basale (BM) est une fine feuille de matrice extracellulaire adhérente aux cellules (ECM) en couches essentielle à la structure épithéliale et à la morphogenèse1. Il comprend environ 50 protéines et se trouve partout sous-jacent aux cellules épithéliales et endothéliales, ainsi qu’aux cellules squelettiques, lisses et cardiaques et aux adipocytes 1,2,3. Les trois principaux composants du BM du côté basal des cellules épithéliales sont le collagène IV, le perlécan et les laminines. Le BM sous-tend les cellules épithéliales et est responsable ....
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Protocole
1. Préparation des mouches pour les dissections ovariennes
- Mettez 10-15 mouches femelles Drosophila melanogaster (âgées de 1 à 2 jours) du génotype souhaité dans un flacon étroit contenant environ 8 mL de milieu de mouche drosophila saupoudré d’une petite quantité de levure de boulanger granulée 2-3 jours avant la dissection à 25 ° C. L’ajout de quelques mâles au flacon peut augmenter le rendement de la chambre à œufs. Cependant, assurez-vous que le nombre total de mouches ne dépasse pas 20, car cela peut affecter négativement le développement des ovaires.
NOTE: Une description des hommes et des femmes de la drosoph....
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Résultats
Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour imager et caractériser efficacement et avec précision le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines BM dans les cellules épithéliales polarisées, telles que la FE de l’ovaire de la drosophile . Ensuite, nous fournissons les résultats anticipés obtenus à l’aide des méthodes décrites, ainsi que des conseils utiles et des pièges potentiels. Pour ce faire, Vkg-GFP, un Vkg marqué de manière endogène (Drosophila Col IV) est utilisé. Cependant, les.......
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Discussion
Le BM est essentiel pour la morphogenèse embryonnaire et organique, et les fonctions physiologiques adultes. De plus, le BM agit comme une plate-forme de signalisation pour l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et fournit aux tissus un support2. Pourtant, les mécanismes qui régulent le bon placement des protéines BM sont mal compris. Une meilleure compréhension des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire et à la sécrétion polarisée des protéines BM nécessite une ana.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à Julie Merkle pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la subvention R15GM137236 des NIH à O.D. Les images confocales et super-résolution ont été acquises à l’aide d’un Zeiss LSM 900 avec Airyscan 2, acheté avec la subvention NSF IRM 2018748.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 phalloïdine | Invitrogen | A22283 | F-Actin Tache (1/500 de 66µ ; M) |
| Alexa Fluor 647 phalloïdine | Invitrogen | A22287 | F-Actine Tache (1/100 de 66µ ; M)) |
| Anticorps anti-GM130 | abcam | ab30637 | Pour la coloration de Golgi (colocalisation) ; utilisation comme concentration de 7µ ; g/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Milieu de montage |
| Levure de boulanger (levure sèche active) | Genesee Scientific | 62-103 | Pour engraisser les overies pour la dissection |
| Albumine sérique bovine (solution à 30 %) | Sigma-Aldrich | A7284 | Pour solution de |
| blocage Puits de dépression | Sciences de la microscopie électronique | 7156101 | Pour la dissection (une lame de concavité en verre peut être utilisée à la place) |
| Aiguille de dissection | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Incubateur de drosophiles | Genesee Scientific/Invictus Mouches | ||
| : Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock : UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | ARNi contre Crag |
| Mouches : Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Mouches : Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Pilotez l’expression de l’ARNi de Crag dans la pince FE | ||
| (Dumont 5) | Outils de science fine | 11251-30 | Pour la dissection |
| Concavité de verre Lame | Microscopie électronique Sciences | 7187804 | Pour la dissection (des puits de dépression peuvent être utilisés à la place) |
| IgG anti-lapin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Anticorps secondaire (anticorps GM130) (5 µ ; g/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | Teinture d’ADN (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific : 06-666 | Essuie-glaces à tâches délicates |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope ; M165 FC | Leica | Pour l’imagerie des ovaires | |
| Lames de microscope | Corning | 294875X25 | Lames de microscope |
| Plate-forme à bascule | Corning Life Sciences | 6720 | Pour la fixation et la coloration des ovaires |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Mouche Alimentaire |
| Paraformaldéhyde 20 % | Microscopie électronique en solution Sciences | Fisher Scientifique : 15713 | Pour PFA 4 % |
| Phosphate Tamponné Saline Comprimés | Scientific BP2944100 | Pour Solution PBS | |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Montage Medium Square |
| Cover Glass | Corning | 285022 | Cover Glass pour lames de microscope |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Pour PBST |
| Zeiss LSM 900 avec Airyscan 2 | Microscope confocal et super-résolution | Zeiss | |
| Stéréomicroscope Zeiss Stemi 305 Microscope | de dissection | Zeiss | |
| Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Acquisition et traitement | d’images Zeiss |
Références
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., ....
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Réimpressions et autorisations
