Detta protokoll beskriver extraktionen av icke-proteinaminosyror från biologiska matriser via triklorättiksyra (TCA) proteinutfällning och syrahydrolys före analys med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri.
Icke-proteinaminosyror (NPAA) är en stor klass av aminosyror (AA) som inte är genetiskt kodade för översättning till proteiner. Analysen av NPAA kan ge viktig information om cellulärt upptag och/eller funktion, metaboliska vägar och potentiell toxicitet. β-metylamino-L-alanin (BMAA) är en neurotoxisk NPAA som produceras av olika algarter och är förknippad med en ökad risk för neurodegenerativa sjukdomar, vilket har lett till betydande forskningsintresse. Det finns många sätt att extrahera AA för analys, med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri som den vanligaste, vilket kräver proteinutfällning följt av sur hydrolys av proteinpelleten. Studier av förekomsten av BMAA hos algarter ger motstridiga resultat, med användning av ovaliderad provberedning/extraktion och analys som en primär orsak. Liksom de flesta NPAA är proteinutfällning i 10% vattenhaltig TCA och hydrolys med rökande HCl den mest lämpliga formen av extraktion för BMAA och dess isomerer aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB). Detta protokoll beskriver stegen i en validerad NPAA-extraktionsmetod som vanligtvis används i forsknings- och undervisningslaboratorier.
Aminosyror är kemiska föreningar som innehåller minst en amin- och karboxylfunktionell grupp. Vissa aminosyror innehåller också en iminogrupp, en annan funktionell syragrupp än karboxylsyra; Andra aminosyror har amingrupper som inte är bundna till α-kolgrupp1. Det finns över 500 aminosyror2, varav 22 är kända som proteinaminosyror som används för genetisk kodning i ribosomal proteinsyntes3. Dessa 22 aminosyror kan vidare delas in i essentiella och icke-essentiella. Essentiella aminosyror är nödvändiga för att en organism ska fungera korrekt och kan endast förvärvas av externa källor. Icke-essentiella aminosyror kan syntetiseras i organismen. Klassificeringen av de 22 aminosyrorna i essentiella/icke-essentiella är unik för enskilda arter. Alla andra aminosyror är icke-proteinaminosyror (NPAA) som inte kodas för proteinsyntes. Aminosyror, oavsett om de är protein eller icke-protein, kan också spela en signalerande roll i en organism och fungera som metaboliska mellanhänder4. På grund av deras viktiga och varierande roller kan aminosyranivåer ge en inblick i organismens tillstånd, funktionalitet och metaboliska vägar etc. Det finns två huvudmekanismer genom vilka aminosyror kan införlivas i en polypeptidkedja: ribosomal proteinsyntes, som använder de 22 aminosyrorna vid kodning, och icke-ribosomal peptidsyntes, som tillsammans med proteinaminosyror möjliggör användning av vissa NPAA i syntes. Vissa NPAA kan efterlikna proteinaminosyror, vilket kan leda till att de felaktigt införlivas i peptider och proteiner. Misinkorporeringen orsakar en felveckning av proteiner, vilket i sin tur har skadliga effekter5, såsom felaktig införlivande av NPAA L-3,4 dihydroxifenylalanin (L-DOPA) i stället för tyrosin, vilket negativt påverkar cellulär funktion och hälsa 6,7. En ytterligare källa till införlivade NPAA är genom post-translationell modifiering (PTM) av aminosyrarester. Aminosyrarester modifieras av olika skäl, inklusive förändringar i peptid- eller proteinkonformation, stabilitet och funktionalitet. Vid hydrolys av PTM-innehållande protein eller peptider frigörs dessa modifierade aminosyrarester i sin fria NPAA-form 8,9.
NPAA-β-metylamino-L-alanin (BMAA) som produceras av cyanobakterier, kiselalger och dinoflagellater10 är ett misstänkt neurotoxin som är inblandat som en bidragande faktor till olika neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros / parkinsonism-demenskomplex (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateralskleros och Alzheimers sjukdom 13 . Det föreslås att BMAA felaktigt införlivas i polypeptidkedjan av proteiner i stället för L-serin14 och/eller andra proteinaminosyror. Misinkorporering av BMAA kan leda till felveckning av proteiner, vilket resulterar i avsättning av proteinaggregat i neuroner14. Under det senaste decenniet har intresset för BMAA ökat avsevärt. Ett brett spektrum av cyanobakteriella arter från sötvatten, marina och bräckta miljöer har upptäckts för att producera BMAA15, vilket leder till deras utbredda utbredning i olika ekosystem16,17. Dessutom har BMAA visat sig biomagnifiera genom livsmedelskedjan till den mänskliga födoväven18,19. På grund av de potentiella hälsoeffekterna, bristen på förståelse och inkongruenser av BMAA-toxicitet är det absolut nödvändigt att fortsätta ytterligare forskning tills antingen toxiciteten hos BMAA slutligen förstås eller BMAA anses vara säker20,21.
Analysen av aminosyror i biologiska prover kan delas in i fyra huvudsteg: provberedning, aminosyraderivatisering, separation och detektion samt identifiering och kvantifiering. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) är den föredragna analysmetoden eftersom den ger en riktad och reproducerbar separation och analys av aminosyror.
Provberedningstekniker för analys av cyanobakteriella och andra algprover involverar huvudsakligen en extraktionsmetod för aminosyror i deras fria och proteinbundna former. Under årens lopp har extraktionsmetoderna förblivit relativt förenliga med vanliga element, inklusive upplösningen av provet för att separera de fria aminosyrorna från deras bundna form, följt av proteinutfällning och frisättning av de bundna aminosyrorna genom hydrolys med saltsyra (HCl) vid förhöjda temperaturer22 . Denna extraktionsform har optimerats för proteinaminosyror och används för NPAA. Detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer (figur 1), aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB) hos samma art av cyanobakterier har dock visat inkonsekventa resultat i litteraturen, med en möjlig förklaring som ligger i skillnader i tillväxtförhållanden och/eller stam av alger som producerar varierande eller inga mängder BMAA23 . Det har hävdats att en mer sannolik förklaring till inkonsekvenserna i detektionen och kvantifieringen av BMAA och dess isomerer beror på icke-validerade experimentella protokoll, användningen av ett brett spektrum av analystekniker och otillräcklig experimentell detalj i de rapporterade metoderna16,24 som leder till irreproducerbara data mellan laboratorier. Glover et al.25 och Banack 26 har dock nyligen utvecklat och validerat en analytisk teknik för detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer med hjälp av ultraprestanda vätskekromatografi (UPLC) -MS / MS i enlighet med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia och FDA-riktlinjer som är nödvändiga för validering av ett laboratorium.
Dessa valideringsexperiment fokuserade på separation och detektion av BMAA och dess isomerer och tog inte upp inkonsekvenserna i provberedningsprotokoll. Lage et al.27 jämförde prestandan hos tre vanliga extraktionsmetoder för kvantifiering av BMAA och dess isomerer i cyanobakteriella prover via LC-MS/MS: fastfasextraktion (SPE) av fria aminosyror28,29; En proteinutfällningsmetod som inbegriper en metanolextraktion och acetonutfällning30. och den vanligaste extraktionsmetoden för BMAA, proteinutfällning med triklorättiksyra (TCA)31. De drog slutsatsen att TCA-proteinutfällningen var det optimala protokollet, vilket gav högre BMAA-koncentrationer i testproverna jämfört med de andra extraktionsmetoderna. Deras studie validerade TCA-extraktion med derivatisering av BMAA med användning av 6-aminokinolyl-N-hydroxisuccinimidylkarbamat (AQC) i en cyanobakteriematris, vilket gav en etablerad guide för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara BMAA-data. TCA-aminosyraextraktion är en accepterad och vanlig provberedningsteknik som också kan tillämpas på andra matriser. Aminosyrans stabilitet under hydrolys måste emellertid beaktas för att förhindra nedbrytning eller oxidation, vilket kan övervinnas med användning av kemiska modifierare och reduktionsmedel32. TCA-extraktion används rutinmässigt och lärs ut till nya forskarstudenter, och även om protokollet rapporteras allmänt är ett visuellt hjälpmedel vid tillämpningen av denna metod en värdefull resurs, vilket säkerställer korrekt och konsekvent utförande.
Omvänd faskromatografi används vanligtvis för att separera aminosyror, vilket kräver ett derivatiseringssteg före analyser. Härledningen av aminosyror såsom BMAA möjliggör kromatografisk retention och kan öka upplösningen mellan isomerer. Det ökar också molekylmassan och förbättrar joniseringen i masspektrometern. Flera derivatiserande reagenser har använts för analys av aminosyror via LC-MS/MS, inklusive propylkloroformat (PCF)33, 6-aminokinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)27, 9-fluorenylmetylkloroformat (FMOC)34 och dansylklorid (DC)35. De enda validerade teknikerna för att analysera BMAA använde dock antingen PCF 36 eller AQC24,26,37 som sitt derivatiserande reagens.
Omfattningen av detta protokoll är inriktat på TCA-extraktion av NPAA från cyanobakteriella matriser. Det är en arbetsintensiv metod som rutinmässigt används och lärs ut i akademiska och industriella forskningslaboratorier baserade på manuskript som kan vara korta på detaljer; Därför ger detta protokoll detaljer om proceduren och teknikerna som är involverade i att förbereda prover för analys av fri och bunden BMAA som modellaminosyra.
Extraktionsprotokollet som beskrivs här för analys av NPAA gäller för att analysera aminosyror i biologiska prover. För guider om isolering och odling av cyanobakteriella stammar kan man hänvisa till de metoder som presenteras i studien av Violi et al.38. Det första steget i protokollet tar provet till en punkt där normalisering mellan proverna mot torrvikten kan uppnås. Det andra steget är celllys för att frigöra analyterna och kan utföras med hjälp av en rad tekniker, inklusive mekaniska störningar / lyser såsom sondsljudsbehandling som beskrivs i detta protokoll, frysning / tina cykler, slipning och pärlfräsning och icke-mekaniska störningar såsom enzymatisk, tvättmedel och / eller kemisk lys. Mekanisk störning är känd för att vara fördelaktig jämfört med icke-mekanisk eftersom det möjliggör en större kapacitet hos provet att lysera samtidigt som de intracellulära bindningarna och proteinerna kan förbli intakta41, även om provmatrisen kan diktera den optimala metoden för celllysering.
Proteinutfällning är det kritiska tredje steget i detta protokoll vid extraktion av aminosyror för analys. TCA är det vanligaste lösningsmedlet; Perklorsyra, aceton, metyltertbutyleter (MTBE), metanol och/eller acetonitril 8,42 har emellertid också använts, där varje extraktionsmedel är avsett att extrahera och fälla ut olika substrat. Modellen som beskrivs här extraherar NPAA BMAA och dess isomerer från en cyanobakteriell matris, och även om en rad olika lösningsmedel har använts, är de två vanligaste 10% TCA i vatten (vattenhaltigt) och 10% TCA i aceton. I allmänhet används proteinutfällning med TCA vanligtvis för att extrahera aminosyror för att fraktionera fria aminosyror från de proteinbundna aminosyrorna. Dessutom möjliggör TCA-extraktion att bestämma det totala proteininnehållet, minska föroreningar för den fria fraktionen och minska aktiviteten hos proteaser med minimal proteinnedbrytning43. TCA-extraktionen av den fria fraktionen fungerar genom att initialt skölja ut organiskt lösliga ämnen och lämna efter sig proteiner och olösliga föreningar såsom cellväggsrester i fällningen, som sedan följs av termisk hydrolysextraktion av de proteinbundna aminosyrorna (bunden fraktion) med användning av en stark syra.
Fraktioneringen av den fria fraktionen med 10% vattenhaltig TCA plus ultraljudsbehandling ger den mest omfattande proteinutfällningen jämfört med andra organiska lösningsmedel44 och den bästa aminosyran återvinner42. Vissa studier väljer att använda en syra i kombination med ett organiskt lösningsmedel (dvs. 10% -20% TCA i aceton 43) för att fälla ut fler molekyler, inklusive mindre peptider / biomolekyler, minimera proteinnedbrytning och minska föroreningar som salter43. En annan fördel med 10% TCA i aceton är dess snabbare torkningshastighet vid framställning av pelleten för hydrolys, vilket minimerar fuktrester för att förhindra aminosyramodifiering. Emellertid, 10% vattenhaltiga TCA plus ultraljudsbehandling har bättre extraktion effektivitet av fria aminosyror jämfört med 10% TCA i aceton44 ensam. Dessutom har 10% vattenhaltig TCA-utfällning begränsningar som en lång torkningstid, att inte kunna fälla ut alla proteiner eller små peptider / biomolekyler, och beroende på analyten av intresse (dvs. proteiner eller aminosyror), vilket kräver tillsatser och reduktionsmedel för att förhindra oxidation och nedbrytning45,46.
Detta protokoll använder en kombination av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton för att öka proteinutfällningen, säkerställa att mindre peptider / biomolekyler fälls ut, möjliggöra snabbare pelletstorkningstider och öka extraktionseffektiviteten och dra nytta av båda lösningsmedelsextraktionsegenskaperna. Kombinationen av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton kan dock fälla ut små peptider/biomolekyler i den fria fraktionen efter att 10% TCA i acetonsupernatant kombineras med den vattenfria fraktionen. I detta fall bör utfällningarna överföras till den bundna fraktionen för hydrolys.
Den andra halvan av detta protokoll involverar frisättning av aminosyror (dvs BMAA) från proteinpelleten via syra-ånghydrolys vid förhöjda temperaturer i en syrefri miljö. Den övervägande begränsande faktorn för hydrolyssteget är att det är tidskrävande och mödosamt att förbereda. Inkubationen över natten förhindrar snabb och tidseffektiv provberedning och analys. Dessutom är den kvantitativa överföringen av pelleten från ett centrifugrör till en skalflaska (steg 3.4) en mödosam process som kräver noggrannhet och tålamod för att säkerställa en korrekt normaliseringspunkt till torrvikten. Möjliga problem som användaren kan möta är den ofullständiga överföringen av pelleten, våtfällda proteiner som fastnar på pipettspetsar och det ursprungliga röret och fasta partiklar av pelleten som blockerar pipettspetsen. Ett praktiskt förslag för att underlätta överföringen av pelleten är att ta bort cirka 0,3-0,5 mm från pipettspetsens ände med en sax, så att större pelletspartiklar kan dras och släppas ut i skalflaskan. Denna överföringsmetod är vanlig för proteinextraktion för alla aminosyraanalyser. Ändringar för att förbättra effektiviteten och noggrannheten vid kvantitativ överföring av pelleten till injektionsflaskan med skal bör dock undersökas.
Två former av hydrolystekniker kan användas för att frigöra aminosyror från deras proteinbundna tillstånd: vätskefashydrolys och syra-ånghydrolys. Vätskefashydrolys, som innebär tillsats av 6 M HCl på provet, som sedan placeras i en ugn på 110 °C över natten, är ett alternativ till den syra-ånghydrolys som beskrivs i detta protokoll. Extraktionstekniker som använder vätskefashydrolys kan kräva ytterligare bearbetning, såsom avsaltning, särskilt om AQC-derivatisering väljs, eftersom det kräver grundläggande villkor för märkningav 40. Syra-ånghydrolys undviker avsaltning och ger användaren friheten att välja derivatiseringsteknik vid rekonstituering av den slutliga pelleten före filtrering. Oberoende av den valda hydrolysmetoden kan proverna dessutom kräva ytterligare bearbetning, såsom SPE för matrisrening och koncentration 29,47,48, beroende på valet av derivatiseringsteknik och/eller analytisk analys (t.ex. omvänd fas LC-MS/MS kontra hydrofil interaktion vätskekromatografi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Rekonstitueringen av den slutliga pelleten i 20 mM HCl i detta protokoll är lämplig för derivatisering med PCF-reagenser48via ett kommersiellt tillgängligt aminosyrahydrolyssats39 (se materialtabell). Både AQC och PCF kommer att derivatisera alla aminosyror, protein och icke-protein i ursprung som finns i provet, och selektiviteten hos analyterna erhålls genom användning av LC-MS / MS och dess kombination av retentionstidsmatchning och noggrant urval av kvantifieraren och kvalificeraren MRM38.
Nuvarande hydrolysprotokoll är inte optimerade för frisättning av BMAA, 2,4-DAB och AEG utan för de 22 proteinaminosyrorna baserade på befintliga metoder för proteinhydrolys 32, där inkubation längre än 18 timmar resulterar i nedbrytning och modifiering av vissa aminosyror, vilket påverkar LC-MS/MS-analysen och därmed de erhållna koncentrationerna32. Beach et al.49 undersökte hydrolys över tid (0,5-120 h) för att optimera hydrolys för att analysera BMAA och de proteinogena aminosyrorna. De fann att även om det fanns en tidig snabb frisättning av BMAA under de första 0,5 timmarna av hydrolysen, fortsatte BMAA-nivåerna att öka när hydrolystiden ökade, utan nedbrytning, även efter 5 dagar49. Det finns också fortfarande olika åsikter och frågor om den sanna naturen hos bunden BMAA och dess isomerer, med vissa studier som tyder på att snarare än BMAA-bindning 50,51 eller felaktig införlivande i proteiner14, är BMAA-proteinassociation ytlig52. Det nuvarande samförståndet i analysen av “bunden” BMAA kräver emellertid det validerade och allmänt accepterade hydrolyssteget som bryter isär peptider / proteiner för att frigöra aminosyror och därmed BMAA och dess isomerer.
Återvinningsgraden för 20 proteinaminosyror bestämdes i en studie av Sedgwick et al.42 med hjälp av TCA-extraktion, vilket resulterade i cirka 100% återhämtning. När det gäller BMAA och dess isomerer från algmatriser har studier som jämför effektiviteten av BMAA-extraktion med olika extraktionsmedel funnit att 10% TCA är det mest effektiva för gratis BMAA27. Återvinningsgraden för proteinbunden BMAA extraherad med vätskefashydrolys fastställdes i studier av Glover et al.25 och av Faassen et al.53, där noggrannheten bestämdes av spikade återvinningsmetoder, med en genomsnittlig BMAA-återvinningsgrad på 108,6% respektive 70%. beskrev procedurer för spikåtervinningsexperiment och illustrerade hur återhämtningen skiljer sig beroende på skedet i extraktionsprocessen som spetsen gjordes53. bestämde dessutom effektiviteten hos syra-ångprotokollet som presenteras här, med återvinningshastigheter på 83,6% för BMAA-isomererna spikade före extraktion och 68,6% för de som spikades före hydrolys24. Dessa återvinningar, extraktionsmetoder och analyser validerades ytterligare av Banack 26, med återvinningsgrader på 94% -106% för BMAA i en cyanobakteriell matris och en% relativ standardavvikelse (% RSD) mellan 5.6% och20%, som uppfyller FDA: s kriterier för noggrannhet54. Det rekommenderas att varje laboratorium initialt fastställer dess återhämtningshastigheter och noggrannhet innan detta protokoll används via spikåterställningsexperiment. De återvinningsmetoder som presenteras i Faassen et al.53 och Glover et al.25 kan följas som vägledning.
Alternativa former av hydrolystekniker kan utnyttjas istället för ugnshydrolys över natten för snabbare proteinbunden extraktion av analyten. Till exempel kan en mikrovågsugare avsevärt minska hydrolystiden från 24 timmar till så lite som 10 min55. Mikrovågshydrolys för aminosyror använder samma principer som den konventionella termiska metoden, med hjälp av en handskfack för att förbereda och montera mikrovågskärlet i en syrefri miljö och tillsätta 6 M HCl. När det är lufttätt genomgår kärlet som innehåller provet mikrovågsstrålning. Mikrovågshydrolys har använts för att extrahera aminosyror från olika provmatriser56,57,58; mikrovågshydrolys har dock ännu inte utvecklats och validerats för analys av BMAA.
Sammanfattningsvis är 10% vattenhaltig TCA-proteinutfällning den optimala metoden för att extrahera fria icke-proteinaminosyror från cyanobakteriella matriser27, och termisk hydrolys ger en pålitlig och reproducerbar extraktion av den proteinbundna fraktionen. Detta protokoll för att extrahera NPAA BMAA och dess isomerer från cyanobakterier är validerat och allmänt accepterat. Framtida riktningar för att ytterligare optimera extraktionen av BMAA kommer att fokusera på hydrolyssteget, som utförs enligt specifikationerna för de 22 proteinaminosyrorna. Extraktionsprotokollet som presenteras här bör dock fortfarande betraktas som effektivt och effektivt för att analysera BMAA och dess isomerer via LC-MS / MS.
The authors have nothing to disclose.
D.P.B., K.J.R. och S.M.M. stöds av The Ian Potter Foundation, och J.P.V. är mottagare av ett australiensiskt regeringsforskningsutbildningsprogram, Stipend.
1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
-80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
Analytical Scale Balance | |||
Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
Drying Oven | |||
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
Falcon tube holder | |||
Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
Glass engraver | |||
Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
Ice and container | |||
Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Nitrogen tap with hose | |||
P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
PPE – noise cancelling headphones | |||
PPE – oven gloves | |||
Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
Sample transfer spatula | |||
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
Tweezers | |||
Vacuum Pump with hose |