Det nuvarande protokollet ger en praktisk lösning som möjliggör mätning av apoptos, mitokondriell membranpotential och DNA-skador i mänskliga spermier med en enda cytometer.
Den konventionella spermaparameteranalysen används ofta för att bedöma manlig fertilitet. Studier har dock visat att ~15 % av infertila patienter inte uppvisar några avvikelser i konventionella spermaparametrar. Ytterligare tekniker behövs för att förklara den idiopatiska infertiliteten och upptäcka subtila spermiedefekter. För närvarande avslöjar biomarkörer för spermiefunktion, inklusive spermieapoptos, mitokondriell membranpotential (MMP) och DNA-skador, spermiefysiologi på molekylär nivå och kan förutsäga manlig fertilitet.
Med flödescytometri (FCM) kan var och en av dessa markörer mätas snabbt, exakt och exakt i mänskliga spermaprover, men tidskostnaderna ökar avsevärt och resultaten kan hindras om alla biomarkörer behöver testas med en enda cytometer. I detta protokoll, efter insamling och omedelbar inkubation vid 37 °C för kondensering, analyserades spermaprover ytterligare med avseende på spermieapoptos med hjälp av Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (FITC)/propidiumjodid (PI) färgning. MMP märktes med 5,5′,6,6′-tetraklor-1,1′,3,3′-tetraetyl-benzimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) sond, och DNA-skador bedömdes med hjälp av spermiekromatinstrukturanalysen (SCSA) med akridinorange (AO) färgning. Flödescytometrisk analys av spermiefunktionsmarkörer kan därför vara en praktisk och tillförlitlig verktygslåda för diagnos av infertilitet och utvärdering av spermiefunktion vid både bänk och säng.
Infertilitet har blivit ett folkhälsoproblem, där manlig infertilitet bidrar till 40–50 % av alla fall 1,2. Även om konventionell spermakvalitetsanalys spelar en viktig roll för att bestämma manlig fertilitetspotential, har cirka 15 % av patienterna med infertilitet normala spermieparametrar som spermieantal, motilitet och morfologi3. Dessutom har rutinmässiga spermieundersökningar dålig repeterbarhet, ger begränsad information om spermiernas funktion och kan inte ge en korrekt utvärdering av manlig fertilitet eller återspegla spermiernas subtila defekter. Flera tekniker har utvecklats för att testa spermiernas funktion, såsom hemizona-analysen (HZA), spermiepenetrationsanalysen, hypoosmotiskt svullnadstest, antispermieantikroppstestningen, men dessa metoder är tidskrävande och sårbara för subjektiv påverkan från operatörerna. Därför är det nödvändigt att utveckla snabba och exakta metoder för analys av spermiernas funktion.
FCM är en snabb, encellsanalysteknik som utvecklades på 1970-talet och som har använts i stor utsträckning inom olika områden av cellbiologi och medicin. FCM är ett robust verktyg för utvärdering av spermiers funktion som analyserar spermier märkta med en specifik fluorescenssond4. Spermierna passerar genom en- eller flerkanalslasrar, och spritt ljus och emitterad fluorescens produceras av en laserstråle. Det spridda ljuset inkluderar framåtspritt ljus (FSC) och sidospritt ljus (SSC), som återspeglar storleken på den testade cellen och cellens granularitet eller inre struktur. Dessa signaler samlas in, visas och analyseras av datorsystemet, och följaktligen mäts en rad egenskaper från spermierna snabbt och exakt. Därför är FCM en snabb, objektiv, flerdimensionell och högkapacitetsteknik som har fått allt större uppmärksamhet inom spermieanalys. Användningen av FCM kan kompensera för brister i traditionella metoder och ger ett nytt tillvägagångssätt för detektion av spermiernas inre struktur och funktion.
Spermapoptos är nära besläktad med manlig fertilitet5. Detektion av spermieapoptos är ett viktigt index för att utvärdera spermiernas funktion på molekylär nivå. FCM är allmänt erkänd som en pålitlig och känslig metod för att upptäcka spermapoptos med hjälp av Annexin V-FITC/PI-färgning. Grundprincipen är att fosfatidylserin (PS) överförs från det inre lagret av cellmembranet till dess yttre skikt i det tidiga stadiet av apoptos. Annexin V är ett Ca2+-beroende fosfolipidprotein (vanligtvis märkt av FITC) som har en hög affinitet för PS, och därmed detekterar PS exponerat för den yttre ytan av cellmembranet6. Nekros och apoptos kan särskiljas i kombination med Pl-färgning. Därför används metoden för Annexin V-FITC/PI dubbelfärgning i stor utsträckning, eftersom det är snabbt, enkelt och lätt att upptäcka olika apoptotiska spermier.
En mogen däggdjursspermie innehåller cirka 72-80 mitokondrier7, vilket tyder på en biologisk orsak till att spermier stannar kvar8. Spermiermitokondrier har visat sig spela viktiga roller för att upprätthålla spermiernas rörlighet och fertilitet9. JC-1-färgen, som kan användas som en indikator på MMP i en mängd olika celltyper, är en av de mest populära fluorokromerna för bedömning av spermiernas mitokondriella aktivitet10. JC-1 är ett katjoniskt färgämne som potentiellt ackumuleras i mitokondrierna. JC-1 har en maximal fluorescensemission vid 525 nm (grön) och bildar J-aggregat 11 när de binder till membran med hög potential (ΔΨm, 80-100 mV), vilket resulterar i en förskjutning av fluorescensemissionen till ~590 nm (orange-röd). Följaktligen indikeras spermiemitokondriell depolarisering av en minskning av det röda/gröna fluorescensintensitetsförhållandet, och FCM kan användas för att detektera MMP-nivåer i mänskliga spermaprover.
SCSA-metoden uppfanns av Evenson et al.12 och anses vara ett exakt och repeterbart test med unika dubbelparameterdata (röd vs grön fluorescens) på en skala på 1 024 × 1 024 kanaler 13. I skadade spermier märks DNA och förändrade proteiner i spermiekärnor med AO, och brott på DNA-strängen mäts med röd fluorescens, medan intakta dubbelsträngar avger grön fluorescens i FCM14. Nuförtiden har många metoder utvecklats för att uppskatta spermiernas DNA-integritet. Men till skillnad från SCSA är dessa analyser ofta arbetsintensiva och saknar möjlighet att diagnostisera manlig infertilitet. SCSA-testresultaten korrelerar signifikant med mänsklig DNA-graviditet och missfall, ger övertygande bevis för att SCSA kan vara användbart vid mänsklig spermaanalys och kan fungera som ett värdefullt verktyg för infertilitetskliniker15.
Kromatinintegritet, MMP och apoptos återspeglar olika aspekter av spermiernas funktion, och därmed kan kombinationen av dessa biomarkörer ge en mer omfattande inblick i spermiestatus. FCM kan användas för separata mätningar av antingen kromatinintegritet, MMP eller apoptos i humana spermaprover. Även om kostnaden för FCM och kostnaden för färgämnen har begränsat den breda tillämpningen av dessa tekniker i kliniska laboratorier för reproduktiv hälsa, accepteras deras värde för uppskattning av fruktsamhet.
Eftersom vart och ett av försöken kräver förbehandling av spermaprover, och alla förbehandlade prover måste testas så snart som möjligt, kan samtidig mätning av alla tre biomarkörerna för ett prov med ett enda FCM leda till en lång väntetid för vissa av experimenten och hindra resultatens tillförlitlighet. Detta beror på att spermierna får ytterligare skada under vänteprocessen, om protokollet inte är korrekt ordnat med hänsyn till alla tre experimenten. Denna artikel presenterar ett protokoll som realiserar en flytande mätning av alla tre biomarkörerna i en enda cytometri utan betydande kompromiss med experimentkvaliteten inducerad av förlängda väntetider.
Kromatinintegritet, MMP och apoptos hos humana spermier har visat sig vara värdefulla prediktorer för reproduktiva resultat. I WHO:s senaste laboratoriehandbok för undersökning och bearbetning av mänsklig sperma (sjätte upplagan) lyftes också några av dessa indikatorer (kromatinintegritet och apoptos) fram som utvidgade undersökningar utöver den grundläggande undersökningen av rutinparametrar som spermieantal18. Nyare publikationer tyder också på att dessa indikatorer kan vara känsligare markörer för reaktion på extern farlig exponering, vilket indikerar deras potential för identifiering av reproduktionsskador i ett tidigare skede19,20. Att kombinera dessa indikatorer med rutinundersökningar kan också ge en mer omfattande förståelse för profilen för spermiedysfunktion och komplexiteten hos manliga reproduktionsskador i befolkningen.
Det finns flera nyckelfrågor som väsentligt avgör framgången för spermieanalys med FCM. För det första kräver mätningen av spermier MMP och apoptos omedelbar undersökning efter att sperman har blivit flytande. För att minimera tidskostnaden kan två tekniker separat ta hand om förbehandlingen av MMP och apoptosanalys av ett prov. Eftersom förbehandlingen av apoptos är enklare, skulle den överföras till det flödescytometriska steget snabbare än MMP-analysen. För SCSA-analysen bör färska spermaprover kryokonserveras omedelbart efter tillgänglighet efter förvätskning. Spermaproverna kan sedan förvaras i flytande kväve under en relativt lång period och behöver inte undersökas omedelbart.
Följaktligen kan tidskostnaden för experimentet på plats komprimeras till 40 minuter, vilket är varaktigheten av MMP-analys plus det flödescytometriska steget för spermieanalys. För det andra måste inställningen av grinden i den flödescytometriska plattformen bestämmas separat för varje sats av prover. Spermaproverna med tydliga cellundergrupper i spridningsdiagrammet kan väljas som referens för att rita grindområdet. För det tredje, eftersom det inte finns några allmänt accepterade kliniska referensvärden för indikatorerna i detta experiment, kan historiska resultat användas som ett viktigt verktyg för kvalitetskontroll. Positiva och negativa kontroller uppmuntras också att ställas in i varje omgång mätningar, särskilt för SCSA och MMP.
De representativa resultaten av spermaanalysen som tillhandahålls här härleds med hjälp av en Accuri C6. Tekniken kan dock tillämpas på andra kommersiella plattformar med mindre modifieringar. Vanligtvis skulle totalt 5 × 106 spermier behövas för att uppfylla kravet på mätning av alla indikatorer. Om spermiekoncentrationen i ett prov är mycket lägre än medelnivån, skulle behovet av spermavolymen öka.
I likhet med rutinmässiga spermieparametrar finns det också en märkbar intraindividuell variation i kromatinintegritet, MMP och apoptos hos humana spermier21. Följaktligen kan flera tester av prover som samlats in vid olika tidpunkter ge en mer exakt uppskattning av skadenivån för spermiernas funktion. Även om det inte finns någon rekommenderad period av avhållsamhet före spermieprovtagning för flödescytometrisk analys, kan 2-7 dagars ejakulationsavhållsamhet, som föreslås för rutinmässig spermieanalys av WHO, antas. Det kan bidra till att förbättra jämförbarheten av resultaten mellan laboratorier och mellan olika prover som samlats in från samma män.
En stor begränsning med denna metod är att två av de tre testade biomarkörerna – apoptos och mitokondriell membranpotential – kräver färska spermaprover. Detta kan begränsa deras tillämpning till män som kan lämna spermaprover till laboratoriet. För test av DNA-skada (SCSA) bör referensprover förberedas före försöket för att kalibrera flödescytometern. Det bör noteras att tillämpningen av det nuvarande protokollet kräver ett FCM-instrument i laboratoriet, vilket fortfarande är en stor utmaning för många kliniska laboratorier, även om samarbete med en tredjepartstjänst kan vara ett alternativt val i vissa regioner.
Dessutom är kostnaden för färgämnen och andra reagenser också en ekonomisk faktor för män som kan behöva undersökningen. Slutligen kan protokollet behöva modifieras om olika märken eller versioner av FCM används för att undersöka biomarkörerna. Sammanfattningsvis presenterar denna artikel ett praktiskt tillvägagångssätt för att uppskatta tre biomarkörer för skador på mänskliga spermier med en enda flödescytometrimaskin. Detta kan ge värdefull information om manlig reproduktiv hälsa och komplettera den rutinmässiga spermieundersökningen.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla fältarbetare för deras hjälp och de intervjuade för deras samarbete.
0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
Biological safety hood | Airtech, USA | ||
Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
Equipments | |||
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
Materials | |||
PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |