ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA): בדיקה אבחנתית בסיסטיק פיברוזיס
Summary
פרוטוקול זה מתאר ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA), בדיקה אבחנתית חדשנית לסיסטיק פיברוזיס (CF). מאפיינים מורפולוגיים, כלומר המעוגלות (מדד מעגליות, CI) ונוכחות לומן (יחס עוצמה, IR), הם מדד לפונקציית CFTR. ניתוח של 189 נבדקים הראה אפליה מושלמת בין CF ללא CF.
Abstract
אבחון של סיסטיק פיברוזיס (CF) אינו תמיד פשוט, במיוחד כאשר ריכוז הזיעה הכלוריד הוא בינוני ו/או פחות משתי מוטציות CFTR הגורמות למחלות. מבחני CFTR פיזיולוגיים (הפרש פוטנציאלים באף, מדידת זרם מעיים) נכללו באלגוריתם האבחון אך לא תמיד זמינים או אפשריים (למשל, בתינוקות). אורגנואידים רקטליים הם מבנים תלת-ממדיים שגדלים מתאי גזע שבודדו מקריפטות של ביופסיה רקטלית כאשר הם מתורבתים בתנאים מסוימים. לאורגנואידים מנבדקים שאינם CF יש צורה עגולה ולומן מלא בנוזל, שכן הובלת כלוריד בתיווך CFTR מניעה מים לתוך לומן. אורגנואידים עם פונקציית CFTR פגומה אינם מתנפחים, שומרים על צורה לא סדירה ואין להם לומן נראה לעין. הבדלים במורפולוגיה בין אורגנואידים מסוג CF לבין אורגנואידים שאינם CF מכמתים ב’ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית’ (ROMA) כבדיקה פיזיולוגית חדשנית של CFTR. עבור מבחן ROMA, אורגנואידים מצופים בלוחות 96 באר, מוכתמים בקלצין, ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. הבדלים מורפולוגיים מכמתים באמצעות שני מדדים: מדד המעגליות (CI) מכמת את העגולות של האורגנואידים, ויחס העוצמה (IR) הוא מדד לנוכחות לומן מרכזי. לאורגנואידים שאינם CF יש CI גבוה ו-IR נמוך בהשוואה לאורגנואידים של CF. מדדי ROMA מפלים באופן מושלם 167 נבדקים עם CF מ-22 נבדקים ללא CF, מה שהופך את ROMA לבדיקת CFTR פיזיולוגית מושכת המסייעת באבחון CF. ביופסיות רקטליות יכולות להתבצע באופן שגרתי בכל הגילאים ברוב בתי החולים וניתן לשלוח רקמות למעבדה מרכזית לתרבית אורגנואידית ו-ROMA. בעתיד, ROMA עשוי להיות מיושם גם כדי לבחון את היעילות של מודולטורים CFTR במבחנה. מטרת הדו”ח הנוכחי היא להסביר באופן מלא את השיטות המשמשות את ROMA, כדי לאפשר שכפול במעבדות אחרות.
Introduction
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה אוטוזומלית רצסיבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR). חלבון CFTR הוא תעלת כלוריד וביקרבונט, המבטיחה הידרציה של מספר אפיתליה1. CF היא מחלה רב-מערכתית בעלת עומס גבוה, מקצרת חיים, המתבטאת בעיקר כמחלה נשימתית, אך משפיעה גם על מערכת העיכול, הלבלב, הכבד ומערכת הרבייה2.
מוטציות CFTR הגורמות למחלות מובילות לירידה בכמות או בתפקוד של CFTR , וכתוצאה מכך גורמות להתייבשות ליחה. יותר מ -2,000 וריאנטים בגן CFTR תוארו3, מתוכם רק 466 אופיינו ביסודיות4.
אבחנה של CF יכולה להיעשות כאשר ריכוז הזיעה הכלוריד (SCC) הוא מעל הסף של 60 mmol / L או כאשר שתי מוטציות CFTR הגורמות למחלה (על פי מסד הנתונים CFTR2) מזוהות 4,5. בנבדקים עם SCC מוגבר בינוני בלבד (30-60 מילימול לליטר), המופיע בכ-4%-5% מבדיקות הזיעה6, ומוטציות CFTR בעלות השלכות קליניות שונות או לא ידועות, לא ניתן לאשר או לשלול את האבחנה, גם כאשר יש להם תסמינים תואמי CF או בדיקת סקר חיובית לילודים. במקרים אלה, מבחני CFTR פיזיולוגיים בקו שני (הפרש פוטנציאל האף (NPD) ומדידות זרם מעיים (ICM)) נכללו באלגוריתם האבחון. בדיקות אלה אינן זמינות ברוב המרכזים ואינן ניתנות לביצוע בכל הגילאים, במיוחד בתינוקות5.
אורגנואידים רקטליים הם מבנים תלת-ממדיים הגדלים מתאי גזע של מעי בוגרים Lgr5(+) מקריפטות מעיים המתקבלות באמצעות ביופסיה רקטלית7. אורגנואידים נמצאים בשימוש הולך וגובר במחקר ביו-רפואי, כגון בדיקת טיפול במודולטור ב-CF8. ביופסיה בת קיימא ניתן להשיג על ידי יניקה או ביופסיה מלקחיים, הליך שגורם רק אי נוחות מינימלית והוא בטוח גם בתינוקות, עם שיעורי סיבוכים נמוכים9. הקריפטות שבודדו מהביופסיות הרקטליות מועשרות בתאי גזע, ובתנאי גידול ספציפיים, אלה מתארגנים בעצמם לאורגנואידים רקטליים. המורפולוגיה של אורגנואידים אלה נקבעת על ידי הביטוי והתפקוד של CFTR, הממוקם בקרום האפיקלי של תאי אפיתל. CFTR פונקציונלי מאפשר לכלוריד ולמים להיכנס לומן האורגנואידים, ובכך לגרום לנפיחות של אורגנואידים שאינם CF. אורגנואידים של CF אינם מתנפחים ואין להם לומן נראה לעין10,11.
ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA) מאפשר הבחנה בין אורגנואידים CF לאורגנואידים שאינם CF בהתבסס על הבדלים אלה במורפולוגיה האורגנואידית. אורגנואידים שאינם CF הם עגולים יותר ויש להם לומן נראה לעין, בעוד שההפך הוא הנכון עבור אורגנואידים CF. לצורך בדיקה זו, אורגנואידים ספציפיים למטופל מצופים ב -32 בארות של צלחת 96 באר. לאחר יום אחד של גידול, האורגנואידים מוכתמים בירוק קלצ’ין ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. האורגנואידים שאינם CF מראים צורה מעגלית יותר וחלק מרכזי פחות פלואורסצנטי, שכן לומן מכיל כתמי נוזל וקלצין בלבד. הבדלים אלה במורפולוגיה מכמתים באמצעות שני מדדי ROMA: מדד המעגליות (CI) מכמת את העגולות של האורגנואידים, ואילו יחס העוצמה (IR) הוא מדד לנוכחות או היעדרות של לומן מרכזי. בדוח זה אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לקבלת אינדקסים מפלים אלה, כדי לאפשר שכפול של הטכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA). שני המדדים שחושבו באמצעות ROMA, IR ו-CI, הבדילו בין אורגנואידים לנבדקים עם CF לבין אלה ללא CF בדיוק מושלם. לפיכך, ROMA יכול לתפקד כבדיקת CFTR פיזיולוגית חדשנית המשלימה את SCC ובדיקות אחרות הזמינות כיום13,14,15<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למטופלים ולהורים שהשתתפו במחקר זה. אנו מודים לאבידה ביבי על כל עבודת התרבות עם האורגנואידים. אנו מודים לאלס ארטגרטס, קרוליין ברוניל, קלייר קולארד, ליליאן קוליניון, מוניק דלפוסה, אניה דלפורטה, נטלי פיירטס, ססיל למברמונט, לוט ניובורג, נטלי פיטרס, אן ראמאן, פים סנסן, הילדה סטיבנס, מריאן שולטה, אלס ואן רנסביק, כריסטל ואן דה ברנדה, ברוך ואן דן איינדה, מרלין ונדרקרקן, אינגה ואן דייק, אודרי וגנר, מוניקה ווסקייביץ’ וברנרד ונדריקס על התמיכה הלוגיסטית. אנו מודים גם ל-Mucovereniging/Association Muco, ובמיוחד לסטפן ג’וריס ולד”ר יאן ונליווה, על התמיכה והמימון שלהם. אנו מודים לכל משתפי הפעולה מפרויקט האורגנואיד הבלגי: הדוויג’ בובולי (CHR Citadelle, ליאז ‘, בלגיה), לינדה בולאנז’ה (בתי חולים אוניברסיטאיים לוון, בלגיה), ז’ורז ‘ קזימיר (HUDERF, בריסל, בלגיה), בנדיקט דה מאייר (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), אלקה דה וכטר (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה), דני דה לוזה (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), איזבל אטיין (CHU Erasme, בריסל, בלגיה), לורנס הנסנס (HUDERF, בריסל), כריסטיאן קנופ (CHU Erasme, בריסל, בלגיה), מוניק לקסנה (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), ויקי נובה (GZA בית החולים סנט וינסנטיוס אנטוורפן), דירק סטאסן (GZA סנט וינסנטיוס בית החולים אנטוורפן), סטפני ואן בירבליט (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), אווה ואן ברקל (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), קים ואן הורנביק (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), Eef Vanderhelst (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה), Stijn Verhulst (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), סטפני וינקן (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
