Rektal organoid morfologianalys (ROMA): En diagnostisk analys vid cystisk fibros
Summary
Detta protokoll beskriver rektal organoid morfologianalys (ROMA), en ny diagnostisk analys för cystisk fibros (CF). Morfologiska egenskaper, nämligen rundheten (cirkularitetsindex, CI) och närvaron av en lumen (intensitetsförhållande, IR), är ett mått på CFTR-funktionen. Analys av 189 försökspersoner visade perfekt diskriminering mellan CF och icke-CF.
Abstract
Diagnos av cystisk fibros (CF) är inte alltid okomplicerad, särskilt när svettkloridkoncentrationen är mellanliggande och / eller mindre än två sjukdomsframkallande CFTR-mutationer kan identifieras. Fysiologiska CFTR-analyser (nasal potentialskillnad, tarmströmmätning) har inkluderats i den diagnostiska algoritmen men är inte alltid lättillgängliga eller genomförbara (t.ex. hos spädbarn). Rektala organoider är 3D-strukturer som växer från stamceller isolerade från krypter av en rektal biopsi när de odlas under specifika förhållanden. Organoider från icke-CF-ämnen har en rund form och en vätskefylld lumen, eftersom CFTR-medierad kloridtransport driver vatten in i lumen. Organoider med defekt CFTR-funktion sväller inte, behåller en oregelbunden form och har ingen synlig lumen. Skillnader i morfologi mellan CF- och icke-CF-organoider kvantifieras i ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) som en ny CFTR-fysiologisk analys. För ROMA-analysen är organoider pläterade i 96-brunnsplattor, färgade med calcein och avbildade i ett konfokalmikroskop. Morfologiska skillnader kvantifieras med hjälp av två index: Cirkularitetsindexet (CI) kvantifierar organoidernas rundhet och intensitetsförhållandet (IR) är ett mått på närvaron av en central lumen. Icke-CF-organoider har en hög CI och låg IR jämfört med CF-organoider. ROMA-index diskriminerade perfekt 167 personer med CF från 22 försökspersoner utan CF, vilket gör ROMA till en tilltalande fysiologisk CFTR-analys för att hjälpa till med CF-diagnos. Rektala biopsier kan rutinmässigt utföras i alla åldrar på de flesta sjukhus och vävnad kan skickas till ett centralt laboratorium för organoidodling och ROMA. I framtiden kan ROMA också komma att tillämpas för att testa effekten av CFTR-modulatorer in vitro. Syftet med denna rapport är att fullständigt förklara de metoder som används för ROMA, för att möjliggöra replikering i andra laboratorier.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en autosomal recessiv sjukdom som orsakas av mutationer i CF-transmembrankonduktansregulatorn (CFTR) -genen. CFTR-proteinet är en klorid- och bikarbonatkanal, vilket säkerställer hydrering av flera epitel1. CF är en sjukdom med hög börda, livsförkortande, multisystem, som främst manifesterar sig som en andningssjukdom, men också påverkar mag-tarmkanalen, bukspottkörteln, levern och reproduktionskanalen2.
Sjukdomsframkallande CFTR-mutationer leder till en minskning av mängden eller funktionen av CFTR , vilket i sin tur orsakar uttorkning av slem. Mer än 2 000 varianter i CFTR-genen har beskrivits3, varav endast 466 har karakteriserats grundligt4.
En diagnos av CF kan ställas när antingen svettkloridkoncentrationen (SCC) ligger över tröskeln på 60 mmol / L eller när två sjukdomsframkallande CFTR-mutationer (enligt CFTR2-databasen) identifieras 4,5. Hos patienter med endast mellanförhöjd (30-60 mmol / L) SCC, som förekommer i cirka 4% -5% av svetttesterna6, och CFTR-mutationer av varierande eller okänd klinisk konsekvens, kan diagnosen inte bekräftas eller uteslutas, även om de har CF-kompatibla symtom eller ett positivt neonatalt screeningtest. För dessa fall har andra linjens fysiologiska CFTR-analyser (nasal potentialskillnad (NPD) och tarmströmmätningar (ICM)) inkluderats i den diagnostiska algoritmen. Dessa tester är inte lätt tillgängliga på de flesta centra eller genomförbara i alla åldrar, särskilt hos spädbarn5.
Rektala organoider är 3D-strukturer odlade från Lgr5 (+) vuxna tarmstamceller från tarmkrypter erhållna genom rektal biopsi7. Organoider används alltmer i biomedicinsk forskning, såsom testning av modulatorbehandling i CF8. En livskraftig biopsi kan erhållas genom antingen sug- eller pincettbiopsi, ett förfarande som endast orsakar minimalt obehag och är säkert även hos spädbarn, med låga komplikationsfrekvenser9. Krypterna isolerade från rektala biopsier berikas i stamceller, och under specifika odlingsförhållanden organiserar dessa sig själv i rektala organoider. Morfologin hos dessa organoider bestäms av uttrycket och funktionen hos CFTR, som ligger vid epitelcellernas apikala membran. Funktionell CFTR tillåter klorid och vatten att komma in i organoidlumen, vilket inducerar svullnad av icke-CF-organoider. CF-organoider sväller inte och har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologianalys (ROMA) möjliggör diskriminering mellan CF och icke-CF-organoider baserat på dessa skillnader i organoidmorfologi. Icke-CF-organoider är mer runda och har en synlig lumen, medan motsatsen gäller för CF-organoider. För denna analys pläteras patientspecifika organoider i 32 brunnar med en 96-brunnsplatta. Efter 1 dags odling färgas organoiderna med kalceingrönt och avbildas i ett konfokalmikroskop. De icke-CF-organoiderna visar en mer cirkulär form och en mindre fluorescerande central del, eftersom lumen endast innehåller vätske- och kalceinfläckar. Dessa skillnader i morfologi kvantifieras med hjälp av två ROMA-index: cirkularitetsindexet (CI) kvantifierar organoidernas rundhet, medan intensitetsförhållandet (IR) är ett mått på närvaron eller frånvaron av en central lumen. I den här rapporten beskriver vi i detalj protokollet för att erhålla dessa diskriminerande index, för att möjliggöra replikering av tekniken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för rektal organoid morfologianalys (ROMA). De två indexen beräknade med ROMA, IR och CI, skilde organoider från personer med CF från de utan CF med perfekt noggrannhet. ROMA skulle således kunna fungera som en ny fysiologisk CFTR-analys som kompletterar SCC och andra för närvarande tillgängliga tester13,14,15.
Protokollet är beroende av användni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar de patienter och föräldrar som deltog i denna studie. Vi tackar Abida Bibi för allt odlingsarbete med organoiderna. Vi tackar Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz och Bernard Wenderickx för logistiskt stöd. Vi tackar också Mucovereniging/Association Muco, och särskilt Stefan Joris och Dr. Jan Vanleeuwe, för deras stöd och finansiering. Vi tackar alla medarbetare från det belgiska organoidprojektet: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgien), Linda Boulanger (Universitetssjukhuset Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Bryssel, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien), Danny De Looze (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bryssel, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Bryssel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bryssel, Belgien), Monique Lequesne (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetssjukhuset Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien), Stijn Verhulst (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
