Isogen nyre glomerulus chip konstruert fra humant induserte pluripotente stamceller
Summary
Presentert her er en protokoll for å konstruere et personlig organ-on-a-chip-system som rekapitulerer strukturen og funksjonen til nyreglomerulær filtreringsbarriere ved å integrere genetisk matchede epitel- og vaskulære endotelceller differensiert fra humaninduserte pluripotente stamceller. Dette bioengineered systemet kan fremme nyre presisjon medisin og relaterte applikasjoner.
Abstract
Kronisk nyresykdom (CKD) påvirker 15% av den amerikanske voksne befolkningen, men etableringen av målrettede terapier har blitt begrenset av mangelen på funksjonelle modeller som nøyaktig kan forutsi menneskelige biologiske responser og nefrotoksisitet. Fremskritt i nyre presisjon medisin kan bidra til å overvinne disse begrensningene. Tidligere etablerte in vitro-modeller av humane nyreglomerulus – det primære stedet for blodfiltrering og et sentralt mål for mange sykdommer og narkotikatoksisiteter – bruker imidlertid heterogene cellepopulasjoner med begrensede funksjonelle egenskaper og uovertruffen genetisk bakgrunn. Disse egenskapene begrenser deres anvendelse betydelig for pasientspesifikk sykdomsmodellering og terapeutisk oppdagelse.
Dette papiret presenterer en protokoll som integrerer humant indusert pluripotent stamme (iPS) celleavledet glomerulært epitel (podocytter) og vaskulært endotel fra en enkelt pasient for å konstruere en isogen og vaskularisert mikrofluidisk nyreglomerulus-chip. Den resulterende glomerulus-brikken består av stamcelleavledede endotel- og epitelcellelag som uttrykker avstamningsspesifikke markører, produserer kjellermembranproteiner og danner et vev-vevsgrensesnitt som ligner nyrenes glomerulære filtreringsbarriere. Den konstruerte glomerulusbrikken filtrerer selektivt molekyler og rekapitulerer legemiddelindusert nyreskade. Evnen til å rekonstituere strukturen og funksjonen til nyreglomerulus ved hjelp av isogene celletyper skaper muligheten til å modellere nyresykdom med pasientspesifisitet og fremme bruken av organer-på-chips for nyrepresisjonsmedisin og relaterte applikasjoner.
Introduction
Organ-on-a-chip-enheter er dynamiske 3D in vitro-modeller som benytter molekylær og mekanisk stimulering, samt vaskularisering, for å danne vev-vevsgrensesnitt som modellerer strukturen og funksjonen til bestemte organer. Tidligere etablerte organ-on-a-chip-enheter som hadde som mål å rekapitulere nyrens glomerulus (glomerulus-chips) besto av dyrecellelinjer1 eller menneskelige primære og udødelige cellelinjer av heterogene kilder 2,3. Bruken av genetisk heterogene cellekilder presenterer variasjoner som signifikant begrenser studiene av pasientspesifikke responser og genetikk eller sykdomsmekanismer 4,5. Å adressere denne utfordringen avhenger av tilgjengeligheten av isogene cellelinjer som stammer fra spesifikke individer med bevarte molekylære og genetiske profiler for å gi et mer nøyaktig mikromiljø for engineering in vitro-modeller 2,3,6. Isogene cellelinjer av menneskelig opprinnelse kan nå enkelt genereres på grunn av fremskritt i human iPS-cellekultur. Fordi menneskelige iPS-celler vanligvis er ikke-invasivt hentet, kan fornye seg på ubestemt tid og differensiere til nesten hvilken som helst celletype, tjener de som en attraktiv kilde til celler for etablering av in vitro-modeller, for eksempel glomerulus-brikken 7,8. Den glomerulære filtreringsbarrieren er det primære stedet for blodfiltrering. Blod filtreres først gjennom vaskulært endotel, den glomerulære kjellermembranen, og til slutt gjennom spesialisert epitel kalt podocytter. Alle tre komponentene i filtreringsbarrieren bidrar til selektiv filtrering av molekyler. Presentert her er en protokoll for å etablere en organ-on-a-chip-enhet forbundet med vaskulært endotel og glomerulært epitel fra en enkelt human iPS-cellekilde. Selv om denne protokollen er spesielt nyttig for å konstruere en isogen og vaskularisert chip for å rekapitulere den glomerulære filtreringsbarrieren, gir den også en blåkopi for å utvikle andre typer personlige organer-på-chips og multiorganplattformer som et isogent ‘body-on-a-chip’ system.
Protokollen beskrevet her begynner med divergerende differensiering av humane iPS-celler i to separate linjer – laterale mesoderm- og mesodermceller, som deretter differensieres til henholdsvis vaskulært endotel og glomerulært epitel. For å generere laterale mesodermceller ble humane iPS-celler sådd på kjellermembranmatrise 1-belagte plater og dyrket i 3 dager (uten medieutveksling) i N2B27-medium supplert med Wnt-aktivatoren, CHIR 99021, og den potente mesoderminduktoren, beinmorfogenetisk 4 (BMP4). De resulterende laterale mesodermcellene ble tidligere preget av ekspresjon av brachyury (T), blandet parlignende homeobox (MIXL) og eomesodermin (EOMES)9. Deretter ble de laterale mesodermcellene dyrket i 4 dager i et medium supplert med VEGF165 og Forskolin for å indusere vaskulære endotelceller som ble sortert ut basert på VE-Cadherin og / eller PECAM-1-uttrykk ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS). De resulterende vaskulære endotelceller (viEC) ble utvidet ved å dyrke dem på kjellermembranmatrise 3-belagte kolber til de var klare til å frø i den mikrofluidiske enheten.
For å generere mesodermceller ble humane iPS-celler sådd på kjellermembranmatrise 2-belagte plater og dyrket i 2 dager i et medium som inneholder Activin A og CHIR99021. De resulterende mesodermcellene ble karakterisert ved ekspresjon av HAND1, goosecoid og brachury (T) som beskrevet tidligere 2,10,11. For å indusere intermediær mesoderm (IM) celledifferensiering ble mesodermcellene dyrket i 14 dager i et medium supplert med BMP-7 og CHIR99021. De resulterende IM-cellene uttrykker Wilms tumor 1 (WT1), parret boksgen 2 (PAX2) og odde-hoppet relatert protein 1 (OSR-1) 2,10,11.
En tokanals polydimetylsiloksan (PDMS)-basert mikrofluidisk chip ble designet for å rekapitulere strukturen til den glomerulære filtreringsbarrieren in vitro. Urinkanalen er 1,000 μm x 1,000 μm (w x h) og kapillærkanaldimensjonen er 1,000 μm x 200 μm (w x h). Sykliske strekk- og avslapningssykluser ble tilrettelagt av de hule kamrene som var tilstede på hver side av væskekanalene. Cellene ble sådd på en fleksibel PDMS-membran (50 μm tykk) som skiller urin- og kapillærkanalene. Membranen er utstyrt med sekskantede porer (7 μm diameter, 40 μm fra hverandre) for å bidra til å fremme intercellulær signalering (figur 1A) 2,12. To dager før IM-induksjonen var fullført, ble de mikrofluidiske brikkene belagt med kjellermembranmatrise 2. viECs ble sådd inn i kapillærkanalen til den mikrofluidiske brikken ved bruk av endotelvedlikeholdsmedium 1 dag før IM-induksjonen var fullført, og brikken ble snudd opp ned for å muliggjøre celleadhesjon på basalsiden av den ECM-belagte PDMS-membranen. På dagen IM-induksjonen ble fullført, ble cellene sådd inn i urinkanalen til den mikrofluidiske brikken ved hjelp av et medium supplert med BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 og all transretinsyre for å indusere podocytdifferensiering i brikken. Dagen etter ble mediereservoarene fylt med podocyttinduksjonsmedium og endotelvedlikeholdsmedium, og 10 % mekanisk belastning ved 0,4 Hz og væskestrøm (60 μL/t) ble påført brikkene.
De cellulariserte mikrofluidiske sjetongene ble dyrket i ytterligere 5 dager ved bruk av Podocyte Induction medium (i urinkanalen) og Endothelial Maintenance medium (i vaskulær kanal). De resulterende nyreglomeruluschipsene ble dyrket i opptil 7 ekstra dager i vedlikeholdsmedier for både podocytt- og endotelcellene. De differensierte podocyttene uttrykte positivt avstamningsspesifikke proteiner, inkludert podocin og nefin 13,14, mens viECs positivt uttrykte avstamningsidentifikasjonsproteinene PECAM-1 og VE-Cadherin, som alle er essensielle molekyler for å opprettholde integriteten til den glomerulære filtreringsbarrieren 15,16 . Podocytter og viECs ble begge funnet å utskille det mest omfattende glomerulære kjellermembranproteinet, kollagen IV, som også er viktig for vevsmodning og funksjon.
Trekomponentsystemet til filtreringsbarrieren – endotel, kjellermembran og epitel – i glomerulus-sjetongene ble funnet å selektivt filtrere molekyler og reagere på en kjemoterapeutisk, nefrotoksisk medikamentbehandling. Resultater fra legemiddelbehandlingen indikerte at glomerulusbrikken kan brukes til nefrotoksisitetsstudier og til sykdomsmodellering. Denne protokollen gir den generelle retningslinjen for prosjektering av en funksjonell mikrofluidisk nyreglomerulusbrikke fra isogene iPS-cellederivater. Nedstrømsanalyser av den konstruerte brikken kan utføres etter ønske fra forskeren. For mer informasjon om bruk av glomerulusbrikken til å modellere medikamentindusert glomerulær skade, se tidligere publikasjoner 2,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten skisserer vi en protokoll for å utlede vaskulært endotel og glomerulært epitel (podocytter) fra en isogen human iPS-cellelinje og bruken av disse cellene til å konstruere et 3D-organ-on-a-chip-system som etterligner strukturen, vev-vevsgrensesnittet og molekylær filtreringsfunksjon av nyreglomerulus. Denne glomerulusbrikken er utstyrt med endotel og glomerulært epitel som sammen gir en barriere for selektiv filtrering av molekyler.
Forskere som er interessert i å tilp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Pratt School of Engineering ved Duke University, Division of Nephrology ved Duke Department of Medicine, et Whitehead-stipend i biomedisinsk forskning og en Genentech Research Award for S. Musah. Y. Roye er mottaker av Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship og William M. “Monty” Reichert Graduate Fellowship fra Duke University’s Department of Biomedical Engineering. Den DU11 (Duke University klone # 11) iPS cellelinjen ble generert på Duke iPSC Core Facility og gitt til oss av Bursac Lab ved Duke University. Forfatterne takker N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya og Y. Zhou for teknisk assistanse og nyttige diskusjoner. Forfatterne vil også takke medlemmer av Musah Lab for nyttige kommentarer til manuskriptet. Forfatterne takker Segura Lab for gaven av et Acuri C6 flowcytometer.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Collagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | Basement membrane matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019) | ||
| Culture medium growth factors and media supplements | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serum-free supplement | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 supplement (50x) without Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | May show lot-to-lot variation |
| Complete medium kit with CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 with glutamine |
| Forskolin (Adenylyl cyclase activator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solution | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months. |
| TGF-Beta inhibitor (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Sterile distilled water | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub module | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15 mm round petri dish | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | Corning | 29442-462 | |
| Aspirating Unit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Centrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells. |
| Hemocytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Upright Confocal Microscope | |||
| Media reservoir (POD Portable Module) | Emulate | POD-1 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-chip | Emulate | S-1 Chip | |
| Organ-chip holder | Emulate | AK-CCR | |
| P10 precision barrier pipette tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF). |
| Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Corning | 352235 | |
| Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped | Corning | 356551 | |
| Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped | Corning | 356525 | |
| Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µm, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 cell culture flask with vent cap | Corning | 430641U | |
| Tissue culture-treated 12 well plates | Corning | 353043 | |
| Tissue culture-treated 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreactor |
| VE-Cadherin CD144 anti-human antibody – APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
- Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
- Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
- Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
- Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
- Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
- Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
- Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
- Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
- Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
- Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).
