Summary
هذه المنهجية، التي شملت التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر، يمكن أن تقيم بشكل فعال تأثير حواجز الأمعاء الوسطى و / أو الغدد اللعابية على عدوى الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
Abstract
تنتشر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مسببات الأمراض المعدية للفقاريات ، عن طريق العديد من أنواع البعوض ، مما يشكل تهديدا خطيرا للصحة العامة. بمجرد تناولها ، يجب أن تتغلب الفيروسات على حاجز الأمعاء الوسطى للبعوض للوصول إلى الدملمف ، حيث قد تنتشر إلى الغدد اللعابية. عندما تلدغ البعوضة ، تنتشر هذه الفيروسات إلى مضيفات فقارية جديدة. وبالمثل ، قد تلتقط البعوضة فيروسات مختلفة. بشكل عام ، قد يدخل جزء صغير فقط من الفيروسات الغدد اللعابية عبر الأمعاء. تتأثر كفاءة انتقال هذه الفيروسات إلى الغدد بحاجزين ماديين موجودين في أنواع مختلفة من البعوض: حواجز الأمعاء الوسطى وحواجز الغدد اللعابية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الفيروس في الغدد اللعابية للزاعجة المصرية بعد التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر. علاوة على ذلك ، فإن تحديد ما إذا كانت الأمعاء و / أو الغدد اللعابية تعيق انتشار الفيروس يمكن أن يساعد في تقييم مخاطر MBVs التي تنتقل عن طريق الزاعجة المصرية.
Introduction
يمكن أن تستمر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مجموعة غير متجانسة من فيروسات الحمض النووي الريبي ، في ناقلات البعوض وتنتشر لاحقا إلى مضيفات الفقاريات1. يتم توزيع MBVs المهمة سريريا بشكل رئيسي في أربع عائلات فيروسية ، وهي Flaviviridae و Togaviridae و Reoviridae و Peribunyavividae 2,3. في العقود الأخيرة ، تم الإبلاغ عن هذه الفيروسات في جميع أنحاء العالم ، مما تسبب في مشاكل الصحة العامة. كواحد من أكثر فيروسات MBV المعروفة ، أصبح فيروس حمى الضنك (DENV) أكثر الفيروسات المنقولة بالمفصليات الناشئة أو معاودة الظهور انتشارا في أكثر من 100 دولة خلال السنوات ال 20الماضية 4. منذ اكتشاف فيروس زيكا (ZIKV) في الداخل ، أبلغت جميع البلدان والأقاليم المدارية وشبه المدارية تقريبا في القارة عن حالات عدوى بشرية بفيروسزيكا 5. من أجل تقييم مخاطر انتقال الفيروس ، ركزت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة على كفاءة البعوض الناقل لهذه الفيروسات 6,7. ونتيجة لذلك، من الأهمية بمكان الوقاية من الأمراض المنقولة بالنواقل ومكافحتها بشكل فعال.
الزاعجة المصرية (Ae. aegypti) ، وهي واحدة من أسهل أنواع البعوض التي يسهل تربيتها في المختبر ، هي ناقل مهم لفيروس حمى الضنك ، وفيروس زيكا ، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس الحمى الصفراء (YFV)8. لفترة طويلة ، تم العثور على Ae. aegypti فقط في القارة الأفريقية وجنوب شرق آسيا ، ولكن في السنوات الأخيرة استعمرت جميع القارات تقريبا9. علاوة على ذلك ، فإن الوفرة العالمية ل Ae. aegypti تنمو باستمرار ، مع زيادة تقدر بنحو 20٪ بحلول نهاية القرن10. من عام 2004 إلى عام 2009 في الصين ، كانت هناك زيادة واضحة في كفاءة ناقل Ae. aegypti لفيروس DENV بسبب ارتفاع درجات الحرارة اليومية11. وقد ارتفع وضع Ae. aegypti باعتباره الناقل الممرض ارتفاعا ملحوظا في الصين. وبالتالي ، لمواجهة هذه التحديات ، من الضروري التحقيق في كفاءة ناقلات Ae. aegypti لنقل الفيروسات.
كمفصليات دموية ، تخترق البعوضة الأنثوية جلد مضيف الفقاريات وتتغذى على الدم. يكتسب البعوض أحيانا فيروسات من مضيفين مصابين بالفيروس ثم ينقل الفيروسات إلى مضيف جديد. وعلى هذا النحو، ولتحديد كفاءة النواقل، يتغذى البعوض على مسحوق دم اصطناعي يحتوي على فيروسات مفصلية من خلال نظام تغذية في بيئة المختبر12. يتم فصل البعوض الفردي إلى رؤوس وأجسام وإفرازات لعاب بعد عدة أيام من الإصابة. لقياس معدلات الإصابة بالفيروس وانتشاره وانتقاله ، تم الكشف عن عيار الفيروس عن طريق النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) أو مقايسة البلاك. ومع ذلك ، لا يصاب جميع البعوض بالتهابات الأمعاء الوسطى والقدرة على نقل الفيروس إلى المضيف التالي بعد تغذية الدم. يرتبط بالحواجز الفسيولوجية للبعوض ، والتي تمنع مسببات الأمراض من اختراق الجسم وتلعب دورا حيويا في مناعتها الفطرية13. تؤثر حواجز الأمعاء الوسطى ، وخاصة حاجز عدوى الأمعاء الوسطى (MIB) وحاجز الهروب من الأمعاء الوسطى (MEB) ، على ما إذا كان الفيروس يمكن أن يصيب الناقل بشكل منهجي والكفاءة التي ينتشر بها. إنه يعيق تحليل عدوى الأنسجة الأخرى ، مثل الغدد اللعابية التي تظهر أيضا عدوى الغدد اللعابية وحواجز الهروب13,14. لتوصيف أفضل لعدوى الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية في الناقل ، يتم عرض بروتوكول مفصل للتغذية عن طريق الفم والتلقيح داخل الصدر للفيروس arbovirus في Ae. aegypti هنا. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على حالات عدوى إضافية بالفيروسات المنقولة بالمفصليات في مجموعة متنوعة من ناقلات البعوض، مثل عدوى فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في الزاعجة النيابة، ويمكن أن يثبت أنه إجراء عملي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير الفيروسات والبعوض
- تحضير الفيروسات
ملاحظة: نفذت جميع العمليات في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2). وينبغي تحديد مستوى السلامة الأحيائية المستخدمة من خلال تقييم مخاطر العامل الممرض واللوائح الخاصة بالدول والأقاليم. يجب تنفيذ العملية في خزانة السلامة البيولوجية.- تلقيح 1 × 106 خلايا C6 / 36 في قارورة ثقافة T75. املأ القارورة ب 10 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل حراريا (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسيط L-15 من Leibovitz (L15) أو وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) للحفاظ على خلايا C6 / 36. - الحفاظ على الخلايا في 5٪ CO2 عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها وإزالة طافية الخلية في اليوم التالي عندما تكون الخلايا 80٪ -90٪ متقاربة.
- أضف 1 مل من تخفيف الفيروس (تعدد العدوى (MOI) = 0.01) في القارورة واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في 5٪ CO2 عند 28 درجة مئوية. تم استخدام فيروس بحيرة إبينور (EBIV)15 ، وهو فيروس أورثوبونيا ينقله البعوض ، كفيروس نموذجي لهذا البروتوكول.
- إزالة طاف وغسل الخلايا 3x مع 5 مل من PBS. املأ القارورة ب 15 مل من وسيط RPMI الجديد بنسبة 2٪ FBS. الحفاظ على قارورة في 5٪ CO2 عند 28 درجة مئوية.
- اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الفيروس عند الوصول إلى العيار الفيروسي المطلوب (بعد ما يقرب من 5 أيام ، اعتمادا على الفيروس المستخدم). بالنسبة ل EBIV ، كانت قيمة العيار هذه 107 وحدات تشكيل البلاك (PFU) / مل. قم بتعبئتها في أنابيب تخزين فردية بغطاء لولبي سعة 2 مل وتخزين الأنابيب التي تحتوي على 0.5-1 مل من الفيروس عند -80 درجة مئوية.
- تلقيح 1 × 106 خلايا C6 / 36 في قارورة ثقافة T75. املأ القارورة ب 10 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل حراريا (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S).
- تحديد عيار الفيروسية
ملاحظة: تحديد عيار الفيروسي من خلال مقايسات البلاك16. تم استخدام BHK-21 لتحديد العيار الفيروسي ل EBIV ، بسبب تأثير الاعتلال الخلوي الواضح (CPE) الذي لوحظ في الخلايا المصابة.- تلقيح 1 × 105 خلايا BHK-21 في كل بئر من 24 لوحة بئر. املأ كل بئر ب 1 مل من وسط DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S. حافظ على الخلايا في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
- قم بعمل ستة (10-6) تخفيفات متتالية 10 أضعاف من المادة الطافية المحتوية على الفيروسات باستخدام وسط DMEM جديد يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S.
- أضف 100 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى كل بئر من 24 لوحة بئر تحتوي على الطبقة الأحادية BHK-21. تخلص من مخفف الفيروس بعد الحضانة لمدة 1 ساعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. أضف 500 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 1.5٪ ميثيل سلولوز إلى كل بئر.
- خلايا مستزرعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (تم العثور على CPE الظاهر بعد 48 ساعة ل EBIV). إصلاح الخلايا بين عشية وضحاها مع 750 ميكرولتر من 3.7 ٪ الفورمالديهايد.
- قم بتلطيخها ب 200 ميكرولتر من البنفسج الكريستالي 2٪ لمدة 15 دقيقة. احسب عدد اللويحات لحساب العيار الفيروسي.
- تربية البعوض في المختبر
ملاحظة: البعوض الخلفي في مختبر احتواء المفصليات من المستوى 1 (ACL-1).- لتحضير المياه المنزوعة الكلور ، املأ دلوا سعة 20 لترا بماء الصنبور واتركه يقف لمدة 7-8 أيام بدون إضاءة. لا تغطي الغطاء.
- احتفظ ببيض ويرقات Ae. aegypti في غرفة البعوض بالشروط التالية: 28 ± 1 درجة مئوية مع دورة ضوء / مظلمة تبلغ 12 ساعة ورطوبة نسبية 75٪ ± 5٪.
- احتفظ بما يقرب من 1000 يرقة في طبق ضحل (22 سم × 15 سم × 6 سم) يحتوي على ماء مكلور بعد فقس البيض. إطعامهم مع ما يقرب من 1/8 ملعقة صغيرة من مسحوق تغذية الفئران. تحديث الطعام يوميا وتغيير الماء كل 2 أيام.
- بمجرد أن تتشرنق اليرقات بعد 5-7 أيام ، استخدم قطارة لمرة واحدة لنقل الشرانق إلى كوب بلاستيكي (7 أونصات) مملوء بالماء منزوع الكلور.
- ضع خمسة أكواب تحتوي على الشرانق (حوالي 200 لكل كوب) في قفص شبكي واحد (30 سم × 30 سم × 30 سم) واحتفظ بالأقفاص في حاضنة الحشرات بنفس الشروط كما في الخطوة 1.3.2.
- ضع إسفنجة صغيرة تحتوي على محلول جلوكوز بنسبة 8٪ (م / وزن) على كل قفص شبكي لإطعام البعوض البالغ. بعد ظهور البالغين ، أخرج الكؤوس بدون الشرانق. احتفظ بالأقفاص الشبكية مع حوالي 1000 بعوضة بالغة لكل قفص في نفس حاضنة الحشرات.
2. التحضير للعدوى الفموية
- تحضير البعوض الإناث للعدوى عن طريق الفم. استخدم آلة امتصاص البعوض لجمع البعوض البالغ من العمر 5-8 أيام. تخديرهم في -20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتحقق لمعرفة ما إذا كان البعوض بالدوار. إذا لم يكن الأمر كذلك ، قم بتخديرها لمدة دقيقة أخرى عند -20 درجة مئوية.
- اسكبهم بسرعة في الأكواب البلاستيكية (24 أونصة) في حوالي 200 بعوضة (إناث وذكور) لكل كوب. قم بتغطية كل كوب بسرعة باستخدام ناموسية جيدة القطع ، متبوعة بغطاء به فتحة (قطرها حوالي 6 سم) في المنتصف.
- تجويع البعوض لمدة 24 ساعة قبل العدوى عن طريق الفم وإعداد وجبة الدم المعدية على النحو التالي.
- في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف BSL-2 ، أخرج مخزون الفيروسات من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج عليه. قم بتخفيف مخزون الفيروس إلى تركيز 2 × 106 PFU / مل مع وسط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S. امزج تخفيف الفيروس مع حجم متساو من دم الحصان الناقص.
ملاحظة: نفذت العمليات في خزانة للسلامة الأحيائية في مختبر ACL-2.
3. إجراء عدوى الفم
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات في مختبر ACL-2. يجب إجراء العملية في صندوق القفازات لمنع البعوض من الهروب.
- أداء التغذية الاصطناعية باستخدام نظام تغذية البعوض الاصطناعي لمدة 1 ساعة.
- قطع أغشية الكولاجين إلى الحجم المناسب (قطرها حوالي 5 سم) ، وتثبيتها في الخزانات مع حلقات o ، ثم إضافة خليط الفيروس والدم (حوالي 3 مل) إلى الخزانات. استخدم سدادات بلاستيكية لإغلاق الخزانات ومنع التسرب.
ملاحظة: تم تنفيذ هذه الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية. - ضع الأكواب البلاستيكية (24 أونصة) التي تحتوي على البعوض في صندوق القفازات. قم بربط الخزانات المختومة على وحدة التغذية FU1 وضع خزانا واحدا على كوب واحد ، ثم قم بتشغيل وحدة الطاقة. إطعام البعوض لمدة 1 ساعة
- قطع أغشية الكولاجين إلى الحجم المناسب (قطرها حوالي 5 سم) ، وتثبيتها في الخزانات مع حلقات o ، ثم إضافة خليط الفيروس والدم (حوالي 3 مل) إلى الخزانات. استخدم سدادات بلاستيكية لإغلاق الخزانات ومنع التسرب.
- تخدير البعوض بواسطة CO2 لعدة ثوان حتى يغمى عليه. باختصار ، ضع مسدس رش ثاني أكسيد الكربون في منتصف الشبكة الشبكية من خلال الفتحة الموجودة على الكوب الذي يحتوي على البعوض ، وافتح القيمة ، واترك كميات هائلة من ثاني أكسيد الكربون تنفث لتخدير البعوض.
- اسكبهم في طبق بتري يوضع على الثلج ويغطى الغطاء بسرعة. اختيار البعوض الإناث احتقان مع ملقط. لتحديد ، الذكور لديهم هوائيات ريشية والإناث لديها هوائيات عادية. نقلها إلى أكواب بلاستيكية جديدة في 50 أنثى البعوض لكل كوب.
ملاحظة: تم اختيار أنثى البعوض المحتقن للحفاظ على الاتساق لأن كمية التغذية تؤثر على المحتوى الفيروسي. - لف الكوب بشبكة ناموسية مقطوعة ثم قم بتغطيته بغطاء به فتحة في المنتصف. قطع الاسفنجة إلى قطعة صغيرة ووضعها على الكوب.
- أضف محلول الجلوكوز بنسبة 8٪ إلى الإسفنجة باستخدام قطارة بلاستيكية يمكن التخلص منها. احتفظ بالأكواب التي تحتوي على إناث البعوض في الحاضنة عند 27 درجة مئوية عند رطوبة 80٪ لمدة 10 أيام. استبدل إسفنجة جديدة مشبعة بالجلوكوز كل 72 ساعة.
4. التحضير للتلقيح داخل الصدر
- تحضير إبر الحقن المجهري على النحو التالي. استخدم PUL-1000 لصنع إبر الحقن المجهري (الشكل 1 أ) مع المعلمات التالية في برنامج مجتذب الإبرة: مؤشر الحرارة = 450 ، القوة (جم) = 110 ، المسافة (مم) = 1.00 ، والتأخير (التأخير) = 0.
- قطع طرف إبرة مسحوبة بملاقط تحت المجهر التشريحي بتكبير 16x (الشكل 1 ب). لا تجعل الطرف كبيرا جدا ، وإلا فإنه يمكن أن يضر البعوض.
- تحضير إناث البعوض كما في الخطوة 2.1.
ملاحظة: أجريت العمليات التالية في مختبر ACL-2. - تحضير تخفيف الفيروس المعدي على النحو التالي:
- أخرج مخزون الفيروسات من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج عليه. تمييع الفيروس إلى تخفيف فيروس 100 nL يحتوي على 100-500 فيروس PFU مع وسط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S. حافظ على تخفيف الفيروس على الجليد.
- ردم الإبرة بالزيت المعدني من خلال حقنة معقمة يمكن التخلص منها. قم بتوصيل الإبرة بالحاقن باتباع التعليمات الموجودة على الجهاز.
- أدخل الإبرة في أنبوب يحتوي على تخفيف الفيروس المعدي. لا تكسر طرف الإبرة. اضغط على زر FILL لملء الإبرة بمحلول الفيروسات. الحجم النهائي لمحلول الفيروس في الإبرة حوالي 4.0 ميكرولتر. بمجرد ملء الإبرة بالفيروس ، احرص على عدم لمسها وإتلافها.
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية.
5. إجراء الحقن الفيروسي تحت المجهر تشريح
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات في مختبر ACL-2.
- تخدير البعوض عند -20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. اسكبهم في طبق بتري يوضع على الثلج ويغطى الغطاء بسرعة.
- اختر ما يقرب من 50 أنثى بعوضة بملاقط وضعها على طبق الجليد. ضع صفيحة الثلج تحت الحاقن وأدخل الإبرة في التجويف الصدري للبعوض تحت مجهر التشريح (الشكل 1 ج).
- اضبط حجم الحقن على 100 نانولتر ومعدل إلى 50 نانولتر / ثانية. اضغط على زر INJECT للسماح لمحلول الفيروس بالتدفق إلى البعوض. في حالة حدوث حقن ناجح ، سوف ينتفخ البطن قليلا.
- ضع البعوضة المصابة في كوب بلاستيكي جديد (24 أونصة) يوضع على الثلج. عندما يكون عدد البعوض المصاب كافيا ، لف الكوب بشبكة ناموسية مقطوعة ثم قم بتغطيته بالغطاء.
- احتفظ بالكوب الذي يحتوي على البعوض المعدي في الحاضنة عند 27 درجة مئوية عند رطوبة 80٪ لمدة 10 أيام. إطعام البعوض كما في الخطوة 3.5.
6. معالجة أنثى البعوض المصابة
ملاحظة: تم تشريح ثلاثة أنسجة / أعضاء مختلفة من كل أنثى بعوضة: القناة الهضمية لحساب معدل الإصابة بالفيروس (VIR) ، والرأس لحساب معدل انتشار الفيروس (VDR) ، واللعاب لحساب معدل انتقال الفيروس (VTR). تم تعريف VIR على أنه عدد البعوض مع الشجاعة الإيجابية للفيروس. تم تعريف VDR على أنه عدد البعوض ذي الرؤوس الإيجابية للفيروس مقسوما على عدد البعوض ذي الأحشاء الإيجابية للفيروس على 100. تم تعريف VTR على أنه عدد البعوض مع اللعاب الإيجابي للفيروس مقسوما على عدد البعوض مع الأمعاء الإيجابية للفيروس على 100.
- جمع اللعاب من أنثى البعوض المصابة
ملاحظة: يجب إجراء العمليات في مختبر ACL-2.- تخدير أنثى البعوض المصابة عن طريق تخدير ثاني أكسيد الكربون كما في الخطوة 3.2. اسكبهم في طبق بتري يوضع على الثلج وأغلق الغطاء بسرعة.
- ضع أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر مملوءة بزيت الغمر جنبا إلى جنب على الطين المطاطي.
- اختر أنثى البعوض بالملاقط وضعها على طبق جليدي. إزالة أرجلهم وأجنحتهم مع ملاقط. ضع جزء فم بعوضة واحدة على كل طرف ماصة.
- جمع اللعاب كما يفرزها البعوض في الزيت لمدة 45-60 دقيقة القادمة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع أطراف الماصة في أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط المخفف للفيروس (وسط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S). قم بطردها عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لطرد اللعاب في الأنابيب. قم بتخزين هذه الأنابيب في -80 درجة مئوية لتحديد معدلات الإرسال لاحقا.
- تشريح البعوض الإناث المصابة
ملاحظة: يجب إجراء العمليات في مختبر ACL-2.- استخدم الملقط لقطع رؤوس إناث البعوض بعد جمع اللعاب. ضع كل رأس في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640.
- أمسك الصدر بملقط ، ثم الجزء قبل الأخير من البطن بملقط آخر واسحبه للخارج. سيتم سحب القناة الهضمية. نظف الأمعاء المسحوبة من أي أنسجة وأعضاء شاردة.
- اغسل القناة الهضمية باستخدام برنامج تلفزيوني وضع كل أمعاء في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640. قم بتخزين هذه الأنابيب في -80 درجة مئوية لتحديد معدل الإصابة بالفيروس ومعدل انتشاره لاحقا.
7. تحليل البيانات
- استخراج الحمض النووي الريبي
- قم بطحن الأنسجة إلى قطع باستخدام آلة طحن خالط الأنسجة ذات درجة الحرارة المنخفضة المضبوطة على المعلمات التالية: تردد التشغيل = 60 هرتز ، وقت التشغيل = 15 ثانية ، وقت التوقف = 10 ثوان ، الدورات = 2 ، ودرجة حرارة الضبط = 4.0 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة عن طريق نظام استخراج الحمض النووي الآلي باتباع تعليمات الجهاز.
- إجراء qRT-PCR
- استخدم مجموعة RT-PCR ذات الخطوة الواحدة لتحديد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي17. استخدم البادئات التالية للكشف عن مقطع EBIV S F: ATGGCATCACCTGGGAAAG و R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. قم بإعداد عملية التفاعل على النحو التالي: المرحلة 1: 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ المرحلة 2: 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.
- تحديد أقل جرعة فيروس للعدوى في الخلايا من خلال التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف الملقحة على الخلايا. استخدم خلايا BHK-21 لتحديد أقل جرعة فيروس من EBIV ، باستخدام التخفيفات حتى 10-7 كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- احسب قيمة Ct لأقل جرعة فيروس بواسطة qRT-PCR. استخدم القيمة الفاصلة ل EBIV-positive بواسطة qRT-PCR كما < 35. استخدم المعادلة التالية لحساب نسخ EBIV في كل عينة:
y = -4.0312x + 3.384 [x = log (نسخ EBIV) ، y = قيمة Ct ، R2 = 0.9905] - احسب معدل الإصابة ومعدل الانتشار ومعدل الانتقال على النحو التالي:
معدل الإصابة (٪) = 100 × (عدد أحشاء البعوض الإيجابية للفيروس / عدد إجمالي البعوض)
معدل الانتشار (٪) = 100 × (عدد رؤوس البعوض الإيجابية للفيروس / عدد أحشاء البعوض الإيجابية للفيروس)
معدل انتقال العدوى (٪) = 100 × (عدد لعاب البعوض الإيجابي للفيروس / عدد أحشاء البعوض الإيجابية للفيروس) - تحليل الاختلافات في المتغيرات المستمرة والاختلافات في معدلات الإصابة بالبعوض ومعدلات الانتشار ومعدلات الانتقال باستخدام تحليل Kruskal-Wallis غير المعلمية لإجراء مقارنات متعددة واختبار فيشر الدقيق عند الاقتضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لفحص توزيع EBIV في البعوض المصاب عن طريق تغذية الدم الاصطناعي (كان العيار النهائي الفيروسي 6.4 × 106 PFU / mL) والحقن داخل الصدر (كانت الجرعة الفيروسية 340 PFU) ، تم تحديد الحمض النووي الريبي الفيروسي في اللعاب والرؤوس وأحشاء البعوض بعد 10 أيام من الإصابة (dpi).
بالنسبة ل Ae. aegypti ، كان عيار فيروس EBIV في أمعاء ورؤوس ولعاب إناث البعوض الملقحة داخل الصدر أعلى بكثير من ذلك الموجود في إناث البعوض المصابة عن طريق الفم (الشكل 2A-C). كان معدل الإصابة ومعدل الانتشار لإناث البعوض الملقحة داخل الصدر 100٪ ، ولكن بالنسبة لإناث البعوض المصابة عن طريق الفم كان 70٪ و 38.1٪ على التوالي (الشكل 2D ، E). بلغ معدل انتقال أنثى البعوض الملقحة داخل الصدر إلى 90٪ ، ولكن بالنسبة لإناث البعوض المصابة عن طريق الفم كان 4.8٪ فقط. وأشار إلى أن أمعاء Ae. aegypti كان لها تأثير مثبط قوي لانتقال الفيروس.
الشكل 1: رسم تخطيطي لطرف الماصة الدقيقة والحقن داخل الصدر . (أ) سحب طرف الماصة الدقيقة قبل كسر الطرف. (ب) طرف ماصة مجهري معد بشكل صحيح ومناسب للتلقيح داخل الصدر. (ج) رسم تخطيطي للحقن داخل الصدر للبعوض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كفاءة البعوض البالغ في النواقل من خلال التغذية الفموية والتلقيح داخل الصدر. تم تحضين إناث البعوض المصابة عند 28 درجة مئوية لمدة 10 أيام. تم اعتبار قيمة p ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم استخدام تحليل Kruskal-Wallis غير المعلمية لإجراء مقارنات متعددة واختبار فيشر الدقيق عند الاقتضاء. تم تعديل هذا الرقم من دراسة أجراها Xia et al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان الهدف من هذه الطريقة هو توفير تقييم شامل لمخاطر فيروس واحد ينقله البعوض من خلال تقييم كفاءة النواقل من خلال التغذية الفموية والتلقيح داخل الصدر.
في تجربة التغذية الفموية ، يجب التقاط البعوض المحتقن ونقله إلى حاوية جديدة ، مما يشكل خطرا شديدا على المشغلين. والسبب في ذلك هو أن أي بعوضة ، بما في ذلك البعوض غير المصاب ، قد تكون مصدرا للعدوى19. وبالتالي ، يجب تخدير البعوض أولا ، كما هو محدد في البروتوكول ، ثم يجب تنفيذ خطوات المتابعة. من المهم ملاحظة أن اختيار البعوض المحتقن ونقله يجب أن يتم في صندوق قفازات مغلق. احتفظ بصندوق القفازات مغلقا أثناء العملية ما لم يكن هناك بعوض يتحرك بحرية في الصندوق.
في تجربة العدوى ، من الأفضل أن يعمل شخصان معا ، وبعد أن يؤكد الشخصان أنه لا يوجد بعوض مهرب في نفس الوقت ، يمكنهما فتح صندوق القفازات لمنع البعوض المصاب من الهروب. إذا حدث هروب ، يجب قتل هذا البعوض أو إعادة القبض عليه. لا ينصح بقتل البعوض المصاب بأيد عارية. يمكن تقليل خطر إصابة المشغلين باستخدام شفاطات الفراغ أو غيرها من الأدوات المناسبة (مثل الملقط وفرش الرسم والأيدي القفاز). بعد التجربة ، قم بتطهير الجزء الداخلي من صندوق القفازات وسطح طاولة العمل بمطهر تقليدي.
ركزت غالبية الأبحاث حول كفاءة ناقل البعوض للفيروسات التي ينقلها البعوض فقط على العدوى الفموية20,21. بالنسبة للعدوى الفموية ، يجب أن تتغلب الفيروسات على العديد من حواجز الأنسجة المرتبطة بالأمعاء الوسطى والغدد اللعابية ليتم إطلاقها في اللعاب14. لم يتم إثبات تأثير الغدة الوسطى والغدة اللعابية على القدرة الناقلة للبعوض في هذه التجربة. عندما يتم الجمع بين التغذية عن طريق الفم والحقن داخل الصدر ، يمكن تقييم حواجز الأنسجة المختلفة بدقة. وفقا لنتائج هذا الإجراء ، تلعب أمعاء Ae. aegypti دورا مهيمنا في كفاءة ناقل الفيروس وقد لا يكون حاجز الغدد اللعابية موجودا (الشكل 2). لهذا ، فإن بروتوكولنا مفيد لتأكيد وجود حواجز الأمعاء الوسطى أو الغدد اللعابية لعدوى الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
وفقا للمنهجية ، تم تحديد الحمض النووي الريبي الفيروسي فقط في العينات. هناك حاجة إلى تحقيقات أخرى ، مثل رؤية virion باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ ، أو تأكيد العدوى باستخدام مقايسات البلاك ، أو الكشف عن البروتين الفيروسي باستخدام مقايسة التألق المناعي ، لتأكيد الفيروسات المعدية في العينات المختلفة. ويمكن تعديل هذه المنهجية واستخدامها لتلقيح فيروسات إضافية ذات أهمية في طائفة واسعة من ناقلات البعوض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
