Summary
Esta metodología, que incluyó la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica, podría evaluar eficazmente la influencia de las barreras del intestino medio y/o de las glándulas salivales en la infección por arbovirus.
Abstract
Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), que son patógenos infecciosos para los vertebrados, se propagan por muchas especies de mosquitos, lo que representa una grave amenaza para la salud pública. Una vez ingeridos, los virus deben superar la barrera del intestino medio del mosquito para llegar a la hemolinfa, desde donde podrían propagarse a las glándulas salivales. Cuando un mosquito pica, estos virus se propagan a nuevos huéspedes vertebrados. Del mismo modo, el mosquito puede recoger diferentes virus. En general, solo una pequeña porción de virus puede ingresar a las glándulas salivales a través del intestino. La eficiencia de transmisión de estos virus a las glándulas se ve afectada por las dos barreras físicas que se encuentran en diferentes especies de mosquitos: las barreras del intestino medio y las barreras de las glándulas salivales. Este protocolo presenta un método para la detección del virus en las glándulas salivales de Aedes aegypti después de la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica. Además, determinar si los intestinos y / o las glándulas salivales dificultan la propagación viral puede ayudar en las evaluaciones de riesgo de MBV transmitidos por Aedes aegypti.
Introduction
Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), un grupo heterogéneo de virus de ARN, pueden persistir en los mosquitos vectores y posteriormente propagarse a los huéspedes vertebrados1. Los MBV clínicamente importantes se distribuyen principalmente en cuatro familias de virus, a saber, Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae y Peribunyavividae 2,3. En las últimas décadas, estos virus se han reportado en todo el mundo, causando problemas de salud pública. Como uno de los MBV más conocidos, el virus del dengue (DENV) se ha convertido en el arbovirus emergente o reemergente más prevalente en más de 100 países durante los últimos 20 años4. Desde el descubrimiento del virus del Zika (ZIKV) en el interior, casi todos los países y territorios tropicales y subtropicales del continente han notificado infecciones humanas por ZIKV5. Con el fin de evaluar el riesgo de transmisión del virus, numerosos estudios en los últimos años se han centrado en la competencia del vector mosquito para estos virus 6,7. Como resultado, es fundamental prevenir y controlar eficazmente las enfermedades transmitidas por vectores.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), uno de los mosquitos más fáciles de criar en el laboratorio, es un vector importante de DENV, ZIKV, virus Chikungunya (CHIKV) y virus de la fiebre amarilla (YFV)8. Durante mucho tiempo, Ae. aegypti se encontró únicamente en el continente africano y en el sudeste asiático, pero en los últimos años ha colonizado casi todos los continentes9. Además, la abundancia global de Ae. aegypti ha estado creciendo continuamente, con un aumento estimado del 20% para fines del siglo10. De 2004 a 2009 en China, hubo un aumento evidente en la competencia vectorial Ae. aegypti para DENV debido a temperaturas diarias más altas11. El estado de Ae. aegypti como vector patógeno ha aumentado significativamente en China. En consecuencia, para abordar estos desafíos, es necesario investigar la competencia vectorial de Ae. aegypti para transmitir virus.
Como artrópodo hematófago, el mosquito hembra perfora la piel de un huésped vertebrado y se alimenta de la sangre. Los mosquitos ocasionalmente adquieren virus de huéspedes infectados por virus y luego transfieren los virus a un nuevo huésped. Como tal, para determinar la competencia del vector, los mosquitos son alimentados con una harina de sangre artificial que contiene arbovirus a través de un sistema de alimentación en el entorno de laboratorio12. Los mosquitos individuales se separan en cabezas, cuerpos y secreciones de saliva varios días después de la infección. Para medir las tasas de infección, diseminación y transmisión del virus, se han detectado títulos de virus mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) o ensayo de placa. Sin embargo, no todos los mosquitos desarrollan infecciones del intestino medio y la capacidad de transferir un virus al siguiente huésped después de la alimentación con sangre. Está relacionado con las barreras fisiológicas de los mosquitos, que evitan que los patógenos penetren en el cuerpo y juegan un papel vital en su inmunidad innata13. Las barreras del intestino medio, en particular la barrera de infección del intestino medio (MIB) y la barrera de escape del intestino medio (MEB), influyen en si el virus podría infectar el vector sistémicamente y la eficiencia con la que se propaga. Obstruye el análisis de la infección de otros tejidos, como las glándulas salivales, que también presentan infección de las glándulas salivales y barreras de escape13,14. Para caracterizar mejor la infección del intestino medio y las glándulas salivales en el vector, se presenta aquí un protocolo detallado para la alimentación oral y la inoculación intratorácica de arbovirus en Ae. aegypti. Este protocolo podría aplicarse a infecciones adicionales por arbovirus en una variedad de mosquitos vectores, como la infección por DENV y ZIKV en Aedes spp., y podría resultar un procedimiento practicable.
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Protocol
1. Preparación de virus y mosquitos
- Preparación de virus
NOTA: Todos los procesos se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El nivel de contención de bioseguridad utilizado debe determinarse mediante la evaluación de riesgos del patógeno y las regulaciones específicas de las naciones y regiones. El proceso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad.- Inocular 1 x 106 células C6/36 en un matraz de cultivo T75. Llene el matraz con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
NOTA: El medio L-15 de Leibovitz (L15) o el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) también se pueden usar para mantener las células C6/36. - Mantener las células en 5% deCO2 a 28 °C durante la noche y eliminar el sobrenadante celular al día siguiente cuando las células estén 80%-90% confluentes.
- Añadir 1 ml de dilución del virus (Multiplicidad de infección (MOI) = 0,01) en el matraz e incubar las células durante 1 h enCO2 al 5% a 28 °C. El virus del lago Ebinur (EBIV)15, un orthobunyavirus transmitido por mosquitos, se utilizó como virus modelo para este protocolo.
- Retire el sobrenadante y lave las células 3 veces con 5 ml de PBS. Llenar el matraz con 15 ml de medio RPMI nuevo con FBS al 2%. Mantener el matraz enCO2 al 5% a 28 °C.
- Recoja el sobrenadante que contiene el virus cuando se alcance el título viral requerido (después de casi 5 días, dependiendo del virus utilizado). Para EBIV, este valor de título fue de 10a 7 unidades formadoras de placa (UFP)/ml. Subempaquételos en tubos individuales de almacenamiento con tapón de rosca de 2 ml y almacene los tubos que contienen 0,5-1 ml de virus a -80 °C.
- Inocular 1 x 106 células C6/36 en un matraz de cultivo T75. Llene el matraz con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
- Determinación del título viral
NOTA: Determine el título viral a través de los ensayos de placa16. BHK-21 se utilizó para determinar el título viral de EBIV, debido al efecto citopático obvio (CPE) observado en las células infectadas.- Inocular 1 x 105 células BHK-21 en cada pocillo de placas de 24 pocillos. Llene cada pocillo con 1 ml de medio DMEM que contenga 10% de FBS y 1% de P/S. Mantener las células en 5% deCO2 a 37 °C durante la noche.
- Haga seis (10-6) diluciones sucesivas de 10 veces de sobrenadante que contenga virus con medio DMEM fresco que contenga 10% FBS y 1% P / S.
- Agregue 100 μL de diluyente de virus en cada pocillo de placas de 24 pocillos que contengan la monocapa BHK-21. Desechar el diluyente del virus después de la incubación durante 1 h enCO2 al 5% a 37 °C. Agregue 500 μL de DMEM que contenga 1.5% de metilcelulosa a cada pocillo.
- Células de cultivo enCO2 al 5% a 37 °C durante 48 h (el CPE aparente se encontró después de 48 h para EBIV). Fijar las células durante la noche con 750 μL de formaldehído al 3,7%.
- Tañaderlos con 200 μL de cristal violeta al 2% durante 15 min. Cuente el número de placas para calcular el título viral.
- Cría de mosquitos en el laboratorio
NOTA: Mosquitos traseros en un laboratorio de contención de artrópodos de nivel 1 (ACL-1).- Para la preparación del agua declorada, llene un cubo de 20 L con agua del grifo y déjelo reposar durante 7-8 días sin luz. No cubra la tapa.
- Mantener los huevos y larvas de Ae. aegypti en una sala de mosquitos con las siguientes condiciones: 28 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una humedad relativa del 75% ± 5%.
- Mantenga casi 1,000 larvas en un plato poco profundo (22 cm x 15 cm x 6 cm) que contenga agua declorada después de que los huevos eclosionen. Aliméntelos con casi 1/8 cucharadita de polvo de alimento para ratones. Refresque la comida diariamente y cambie el agua cada 2 días.
- Una vez que las larvas pupan después de 5-7 días, use un gotero único para transferir las pupas a un vaso de plástico (7 oz) lleno de agua declorada.
- Coloque cinco tazas que contengan pupas (aproximadamente 200 por taza) en una jaula de malla (30 cm x 30 cm x 30 cm) y mantenga las jaulas en la incubadora de insectos con las mismas condiciones que en el paso 1.3.2.
- Coloque una pequeña esponja que contenga una solución de glucosa al 8% (m / p) en cada jaula de malla para alimentar a los mosquitos adultos. Después de la emergencia adulta, saque las tazas sin pupas. Mantenga las jaulas de malla con aproximadamente 1,000 mosquitos adultos por jaula en la misma incubadora de insectos.
2. Preparación para la infección oral
- Prepare mosquitos hembra para la infección oral. Use la máquina absorbedora de mosquitos para recolectar mosquitos de 5 a 8 días de edad. Anestesiarlos a -20 °C durante 1 min y comprobar si los mosquitos están mareados. Si no, anestesiarlos durante otro minuto a -20 °C.
- Viértalos rápidamente en los vasos de plástico (24 oz) a unos 200 mosquitos (hembra y macho) por taza. Cubra cada taza rápidamente con un mosquitero bien cortado, seguido de una tapa con un agujero (aproximadamente 6 cm de diámetro) en el medio.
- Matar de hambre a los mosquitos durante 24 h antes de la infección oral y preparar harina de sangre infecciosa de la siguiente manera.
- En un gabinete de bioseguridad en condiciones BSL-2, saque las existencias de virus del congelador a -80 °C y descongélelas en hielo. Diluir la cepa de virus a una concentración de 2 x 106 UFP/ml con RPMI 1640 medio que contenga 10% FBS y 1% P/S. Mezclar la dilución del virus con un volumen igual de sangre de caballo desfibrada.
NOTA: Los procesos se llevaron a cabo en un gabinete de bioseguridad en un laboratorio ACL-2.
3. Realizar la infección oral
NOTA: Todos los pasos se realizaron en un laboratorio de ACL-2. El proceso debe realizarse en la guantera para evitar que los mosquitos se escapen.
- Realizar alimentación artificial utilizando el sistema de alimentación artificial de mosquitos durante 1 h.
- Corte las membranas de colágeno al tamaño apropiado (aproximadamente 5 cm de diámetro), asegúrelas a los reservorios con juntas tóricas y luego agregue la mezcla de virus y sangre (aproximadamente 3 ml) a los reservorios. Use tapones de plástico para sellar los depósitos y evitar fugas.
NOTA: Estos pasos se realizaron en un gabinete de bioseguridad. - Coloque los vasos de plástico (24 oz) que contienen mosquitos en la guantera. Atornille los depósitos sellados en el alimentador FU1 y coloque un depósito en una taza, luego encienda la unidad de potencia. Alimentar a los mosquitos durante 1 h
- Corte las membranas de colágeno al tamaño apropiado (aproximadamente 5 cm de diámetro), asegúrelas a los reservorios con juntas tóricas y luego agregue la mezcla de virus y sangre (aproximadamente 3 ml) a los reservorios. Use tapones de plástico para sellar los depósitos y evitar fugas.
- Anestesiar a los mosquitos con CO2 durante varios segundos hasta que se desmayen. En resumen, coloque la pistola rociadora de dióxido de carbono en el medio de la malla de red a través del orificio de la taza que contiene mosquitos, abra el valor y permita que se arrojen grandes cantidades de dióxido de carbono para anestesiar a los mosquitos.
- Viértelos en una placa de Petri colocada sobre hielo y tapa la tapa rápidamente. Elija los mosquitos hembra hinchados con fórceps. Para identificar, los machos tienen antenas plumosas y las hembras tienen antenas lisas. Transfiéralos a nuevos vasos de plástico a 50 mosquitos hembra por taza.
NOTA: Los mosquitos hembra hinchados fueron seleccionados para mantener la consistencia ya que la cantidad de alimentación afecta el contenido viral. - Envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y luego cúbrala con una tapa con un agujero en el medio. Corta la esponja en un trozo pequeño y ponla en la taza.
- Agregue una solución de glucosa al 8% en la esponja con un gotero desechable de plástico. Mantener las copas que contienen mosquitos hembra en la incubadora a 27 °C al 80% de humedad durante 10 días. Reemplace una nueva esponja saturada de glucosa cada 72 h.
4. Preparación para la inoculación intratorácica
- Prepare las agujas de microinyección de la siguiente manera. Utilice un PUL-1000 para hacer agujas de microinyección (Figura 1A) con los siguientes parámetros en el programa de extracción de agujas: índice de calor = 450, fuerza (g) = 110, distancia (mm) = 1.00 y retardo (s) = 0.
- Corte la punta de una aguja tirada con pinzas bajo el microscopio de disección con un aumento de 16x (Figura 1B). No haga la punta demasiado grande, de lo contrario puede dañar a los mosquitos.
- Preparar los mosquitos hembra como en el paso 2.1.
NOTA: Los siguientes procesos se realizaron en un laboratorio ACL-2. - Prepare la dilución del virus infeccioso de la siguiente manera:
- Saque el stock de virus del congelador a -80 °C y descongélelo en hielo. Diluir el virus a una dilución de virus de 100 nL que contenga 100-500 virus PFU con medio RPMI 1640 que contenga 10% FBS y 1% P/S. Mantenga la dilución del virus en hielo.
- Rellene la aguja con aceite mineral a través de una jeringa estéril desechable. Coloque la aguja en el inyector siguiendo las instrucciones de la máquina.
- Inserte la aguja en un tubo que contenga la dilución del virus infeccioso. No rompa la punta de la aguja. Pulse el botón FILL para llenar la aguja con una solución antivirus. El volumen final de la solución de virus en la aguja es de aproximadamente 4,0 μL. Una vez que la aguja esté llena del virus, tenga cuidado de no tocarla y dañarla.
NOTA: Los pasos se realizaron en un gabinete de bioseguridad.
5. Realizar la inyección viral bajo un microscopio de disección
NOTA: Todos los pasos se realizaron en un laboratorio de ACL-2.
- Anestesiar los mosquitos a -20 °C durante 1 min. Viértelos en una placa de Petri colocada sobre hielo y tapa la tapa rápidamente.
- Escoge casi 50 mosquitos hembra con pinzas y colócalos en la placa de hielo. Coloque la placa de hielo debajo del inyector e inserte la aguja en la cavidad torácica del mosquito bajo el microscopio de disección (Figura 1C).
- Ajuste el volumen de inyección a 100 nL y la velocidad a 50 nL/s. Presione el botón INYECTAR para permitir que la solución del virus fluya hacia el mosquito. Si se produce una inyección exitosa, el abdomen se abultará ligeramente.
- Coloque el mosquito infectado en un nuevo vaso de plástico (24 oz) colocado en hielo. Cuando el número de mosquitos infectados sea suficiente, envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y luego cúbrala con la tapa.
- Mantenga la taza que contiene mosquitos infecciosos en la incubadora a 27 °C al 80% de humedad durante 10 días. Alimente a los mosquitos como en el paso 3.5.
6. Procesamiento de los mosquitos hembra infectados
NOTA: Se diseccionaron tres tejidos/órganos diferentes de cada mosquito hembra: el intestino para calcular la tasa de infección por virus (VIR), la cabeza para calcular la tasa de diseminación del virus (VDR) y la saliva para calcular la tasa de transmisión del virus (VTR). VIR se definió como el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus. VDR se definió como el número de mosquitos con cabezas positivas para el virus dividido por el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus por 100. VTR se definió como el número de mosquitos con saliva positiva para el virus dividido por el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus por 100.
- Recolección de saliva de los mosquitos hembra infectados
NOTA: Los procesos deben realizarse en un laboratorio ACL-2.- Anestesiar a los mosquitos hembra infectados mediante anestesia con dióxido de carbono como en el paso 3.2. Viértalos en una placa de Petri colocada sobre hielo y cierre la tapa rápidamente.
- Coloque las puntas de pipeta de 10 μL llenas de aceite de inmersión una al lado de la otra sobre el barro de goma.
- Escoge mosquitos hembra con pinzas y colócalos en una placa de hielo. Quítale las patas y las alas con unas pinzas. Coloque la parte bucal de un mosquito en cada punta de pipeta.
- Recoja la saliva secretada en el aceite por los mosquitos durante los próximos 45-60 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque las puntas de la pipeta en tubos de 1,5 ml que contengan 200 μL de medio diluyente de virus (medio RPMI 1640 que contenga 10 % de FBS y 1 % de P/S). Centrifugarlos a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C para expulsar la saliva en tubos. Almacene estos tubos a -80 °C para la posterior determinación de las velocidades de transmisión.
- Diseccionar los mosquitos hembra infectados
NOTA: Los procesos deben realizarse en un laboratorio ACL-2.- Use pinzas para cortar las cabezas de los mosquitos hembra después de la recolección de saliva. Coloque cada cabezal en un tubo individual que contenga 200 μL de medio RPMI 1640.
- Agarre el tórax con una pinza, luego el penúltimo segmento del abdomen con otra pinza y sáquelo. Se sacará el intestino. Limpie el intestino arrancado de cualquier tejido y órgano perdido.
- Lave el intestino con PBS y coloque cada intestino en un tubo individual que contenga 200 μL de medio RPMI 1640. Conservar estos tubos a -80 °C para determinar posteriormente la tasa de infección por virus y la tasa de diseminación.
7. Análisis de datos
- Extracción de ARN
- Moler los tejidos en trozos con una máquina rectificadora homogeneizadora de tejidos a baja temperatura configurada con los siguientes parámetros: frecuencia de funcionamiento = 60 Hz, tiempo de operación = 15 s, tiempo de pausa = 10 s, ciclos = 2 y temperatura de ajuste = 4.0 ° C.
- Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Extraiga el ARN total de cada muestra mediante un sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del instrumento.
- Realización de qRT-PCR
- Utilice el kit RT-PCR de un solo paso para cuantificar las copias de ARN viral utilizando un instrumento de PCR cuantitativa17. Utilice los siguientes cebadores para la detección del segmento S F del EBIV: ATGGCATCACCTGGGAAAG y R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Configure el proceso de reacción como: etapa 1: 42 °C durante 5 min, 95 °C durante 10 s; etapa 2: 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 20 s.
- Determinar la dosis más baja de virus para la infección en las células a través de las diluciones seriadas de 10 veces inoculadas en las células. Utilice las células BHK-21 para determinar la dosis más baja de EBIV para el virus, utilizando diluciones hasta 10-7 como se describe en el paso 1.2.
- Calcular el valor de Ct de la dosis más baja del virus mediante qRT-PCR. Utilice el valor de corte para EBIV-positivo por qRT-PCR como < 35. Utilice la siguiente ecuación para calcular las copias del EBIV en cada muestra:
y = -4.0312x + 3.384 [x = log (las copias de EBIV), y = valor Ct, R2 = 0.9905] - Calcule la tasa de infección, la tasa de diseminación y la tasa de transmisión de la siguiente manera:
Tasa de infección (%) = 100 x (el número de intestinos de mosquitos positivos para virus / el número total de mosquitos)
Tasa de diseminación (%) = 100 x (el número de cabezas de mosquito con virus positivos / el número de intestinos de mosquitos con virus positivos)
Tasa de transmisión (%) = 100 x (el número de saliva de mosquito con virus positivo / el número de intestinos de mosquitos positivos para virus) - Analice las diferencias en las variables continuas y las diferencias en las tasas de infección por mosquitos, las tasas de diseminación y las tasas de transmisión utilizando el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples y la prueba exacta de Fisher cuando corresponda.
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Representative Results
Para examinar la distribución del EBIV en los mosquitos infectados a través de la alimentación con sangre artificial (el título final viral fue de 6,4 x 106 UFP/ml) y la inyección intratorácica (la dosis viral fue de 340 UFP), se determinaron los ARN virales en saliva, cabezas e intestinos de los mosquitos a los 10 días después de la infección (dpi).
Para Ae. aegypti, el título del virus EBIV en los intestinos, la cabeza y la saliva de los mosquitos hembra inoculados intratorácicamente fue mucho mayor que en los mosquitos hembra infectados oralmente (Figura 2A-C). La tasa de infección y la tasa de diseminación para los mosquitos hembra inoculados intratorácicamente fue del 100%, pero para los mosquitos hembra infectados oralmente fue del 70% y 38,1%, respectivamente (Figura 2D, E). La tasa de transmisión de los mosquitos hembra inoculados intratorácica alcanzó hasta el 90%, pero para los mosquitos hembra infectados oralmente fue solo del 4,8%. Indicó que el intestino de Ae. aegypti tenía un fuerte efecto inhibitorio para la transmisión del virus.
Figura 1: Esquema de la punta de micropipeta y la inyección intratorácica. (A) Tire de la punta de la micropipeta antes de romper la punta. (B) Punta de micropipeta adecuadamente preparada adecuada para la inoculación intratorácica. (C) Esquema de la inyección intratorácica para los mosquitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Competencia vectorial de mosquitos adultos mediante alimentación oral e inoculación intratorácica. Los mosquitos hembra infectados se incubaron a 28 °C durante 10 días. El valor de p ≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. El análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis se utilizó para comparaciones múltiples y la prueba exacta de Fisher cuando fue apropiado. Esta cifra ha sido modificada a partir del estudio de Xia et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo de este método era proporcionar una evaluación integral del riesgo de un virus transmitido por mosquitos mediante la evaluación de la competencia del vector a través de la alimentación oral y la inoculación intratorácica.
En el experimento de alimentación oral, los mosquitos hinchados deben ser recogidos y transferidos a un nuevo contenedor, lo que representa un grave riesgo para los operadores. La razón de esto es porque cualquier mosquito, incluidos los mosquitos no infectados, podría ser una fuente de infección19. En consecuencia, los mosquitos deben ser anestesiados primero, como se especifica en el protocolo, y luego se deben realizar los pasos de seguimiento. Es importante tener en cuenta que la selección de mosquitos hinchados y su transferencia deben realizarse en una guantera sellada. Mantenga la guantera cerrada durante el proceso a menos que no haya mosquitos que se muevan libremente en la caja.
En el experimento de infección, es mejor que dos individuos trabajen juntos, y después de que las dos personas confirmen que no hay mosquitos que escapen al mismo tiempo, pueden abrir la guantera para evitar que los mosquitos infectados escapen. Si se produce un escape, esos mosquitos deben ser asesinados o recapturados. No se recomienda matar mosquitos infectados con las manos desnudas. El riesgo de infección de los operadores se puede reducir mediante el uso de aspiradores de vacío u otras herramientas apropiadas (por ejemplo, fórceps, pinceles, manos enguantadas). Después del experimento, desinfecte el interior de la guantera y la superficie del banco de trabajo con un desinfectante convencional.
La mayoría de las investigaciones sobre la competencia de los mosquitos vectores para los virus transmitidos por mosquitos se han centrado exclusivamente en la infección oral20,21. Para la infección oral, los virus deben superar varias barreras tisulares asociadas con el intestino medio y las glándulas salivales para ser liberados en la saliva14. El efecto de la glándula del intestino medio y la glándula salival sobre la capacidad vectorial del mosquito no se demostró en este experimento. Cuando se combinan la alimentación oral y la inyección intratorácica, las diferentes barreras tisulares pueden evaluarse minuciosamente. De acuerdo con los resultados de este procedimiento, el intestino de Ae. aegypti juega un papel dominante en la competencia vectorial para el virus y la barrera de las glándulas salivales puede no estar presente (Figura 2). Para ello, nuestro protocolo es beneficioso para confirmar la presencia de barreras del intestino medio o de las glándulas salivales a la infección por arbovirus.
De acuerdo con la metodología, solo se identificó ARN viral en las muestras. Otras investigaciones, como ver el virión con un microscopio electrónico de transmisión, confirmar la infección mediante ensayos de placa o detectar proteínas virales con un ensayo de inmunofluorescencia, son necesarias para confirmar los virus infecciosos en las diversas muestras. Esta metodología puede modificarse y utilizarse para inocular virus adicionales de interés en una amplia gama de mosquitos vectores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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