Polyp bail-out är en process som induceras av akut stress, där korallpolyper smälter vävnaden som förbinder dem med sin koloni och lossnar från den för att leva som individer. Det nuvarande protokollet beskriver hur man inducerar korallmikropropagation genom räddningsaktion med hjälp av hypersalin eller kalciumfria havsvattenbehandlingar.
Koraller är koloniala djur som bildas av modulära enheter som kallas polyper. Korallpolyper är fysiologiskt kopplade och förbundna med vävnad. Fenomenet polyp bail-out är en process som induceras av akut stress, där korallpolyper smälter vävnaden som förbinder dem med resten av kolonin och slutligen lossnar från skelettet för att fortsätta leva som separata individer. Korallbiologer har erkänt processen för polypräddning i flera år, men först nyligen har mikropropagaterna som genereras av denna process erkänts som ett modellsystem för korallbiologiska studier. Användningen av polyp bail-out kan skapa ett stort antal klonala enheter från ett enda korallfragment. En annan fördel är att enstaka polyper eller fläckar av polyper enkelt kan visualiseras under ett mikroskop och underhållas i mycket standardiserade billiga miljöer som petriskålar, kolvar och mikrofluidiska chips. Det nuvarande protokollet visar reproducerbara metoder som kan inducera korallmikropropagation och olika metoder för att hålla de enskilda polyperna vid liv på lång sikt. Denna metod kunde framgångsrikt odla polyper av korallarten Pocillopora verrucosa i upp till 8 veckor efter räddningsaktionen, vilket uppvisade det praktiska med att använda enskilda korallpolyper för korallforskning.
Scleractinian eller revbyggande koraller är cnidarians som kan bilda karbonatskelett, skapa rev och strukturellt komplexa ekosystem som kan hittas från djupa till grunda vattenmiljöer1. Tropiska korallrev hyser stor biologisk mångfald och tillhandahåller viktiga ekosystemtjänster, såsom kustskydd och fiskeunderhåll2. De flesta revbyggande koraller på grunt vatten förlitar sig på ett mutualistiskt förhållande till alger av familjen Symbiodiniaceae, som ger den energi som koraller behöver för att bygga sina skelett. Symbiosen mellan korallen och algerna kan brytas av miljöstress, vilket orsakar korallblekning 3,4,5,6. De senaste temperaturavvikelserna har orsakat stora korallblekningshändelser runt om i världen, vilket har lett till masskoralldödlighet och permanent revförstöring 7,8,9,10,11. Eftersom detta fenomen är baserat på utvisning av symbionter genom postvärmestressassocierade cellulära mekanismer, såsom apoptos, autofagi och exocytos, kan korallblekning beskrivas som en cellulär process som har konsekvenser i ekosystemskala 5,6,12, vilket innebär att in vitro-kulturer av korallceller eller vävnader skulle vara tillämpliga för att studera detta fenomen noggrant.
På grund av korallrevens betydelse och de stora hot de har stått inför, särskilt under de senaste två decennierna2, har koraller blivit fokus för forskning för skydd och restaureringsändamål över hela världen13. Utvecklingen av tillvägagångssätt och experimentella system som är tillförlitliga, reproducerbara och erbjuder minimal miljöpåverkan för att studera koraller är dock en stor kamp inom detta område.
Mikropropagation definieras som in vitro-spridning av en organisms genotyp genom odling av dess biologiska material i kontrollerade kärl14,15. Odlingen av celler, vävnader och organ har varit avgörande för växt- och djurbiologin under de senaste decennierna. Det möjliggör massreproduktion av organismer i laboratorier, snabb bedömning av olika behandlingar (såsom läkemedel och läkemedel) och direktstudie av cellfunktion 14,15,16,17. I allmänhet har in vitro-modeller varit användbara för att komplettera och fördjupa studierna av olika organismer under bättre kontrollerade fysiska och kemiska förhållanden. På grund av fördelarna med in vitro-odlingstekniker har olika djurcells- och vävnadsodlingstekniker utvecklats, optimerats och använts som viktiga verktyg inom många forskningsområden, där flera cellinjer har studerats och kommersialiserats för många applikationer 16,17,18.
Många framsteg i kunskapen om cell- och vävnadsodling har gjorts sedan den första djurvävnadskulturen 188217, såsom användning av naturliga och syntetiska medier, uppfinningen av etablerade cellinjer och utvecklingen av 3D-media för att odla en mängd celltyper på ett bättre sätt16,17, 18,19. Cellbiologins område har dock mest fokuserat på en utvald grupp modellorganismer, medan många taxa fortfarande inte har väletablerade in vitro-kulturer av celler, vävnader eller organ20. Till exempel, i korallforskning, har inga odödliga cellinjer använts i stor utsträckning för forskning, vilket begränsar korallcellsforskning till användningen av primära cellkulturer. Dessa kulturer har livskraft begränsad till några veckor21, utan studier som registrerar överlevnaden av enskilda celler från alla korallvävnader i mer än 13 dagar fram till början av 202122. Den första rapporten om hållbara korallcellinjer som publicerades var med Acropora tenuis-celler som levde upp till 6 månader, och nyttan av dessa celler för framtida forskning återstår att utforska23.
För att övervinna begränsningarna i odling av korallcellkulturer och för att upprätthålla en laboratoriekultur som bevarar den övergripande vävnadsorganisationen av koraller har användningen av isolerade polyper nyligen föreslagits som en modell för korallbiologisk forskning24,25. Polyps är de anatomiska enheterna av koraller, och var och en av dem har en mun som ligger i mitten av deras orala skiva och är ansluten till andra polyper av coenosarc i sin aborala region26. Separationen av levande polyper sker naturligt genom processen med polyp bail-out, där akut stress orsakar matsmältningen av coenosarc mellan polyperna, som sedan kan lossna från kolonins skelett 25,27,28. Detta fenomen har rapporterats förekomma i en mängd olika taxa, inklusive oktokoraler29,30,31, svarta koraller32 och scleractinian koraller 25,27,28,32,33, och har kopplats till flera miljöstressorer, såsom brist på kalcium i vatten 24,34, ökad surhet35, hyperosmotiska förhållanden 25,27,32,36, höga temperaturer36,37, svält33, luftexponering25,30 och insekticidförorening28,38. Polyp bail-out har till exempel rapporterats i pocilloporid koraller19, som är brett spridda över hela världen och ofta används som modeller i korallforskning. Arter som tillhör denna grupp, såsom Pocillopora damicornis och Styllophora pistillata, har genererat cirka 30-40 mikropropagat från ett 5 mm fragment25. Detta nummer betonar fördelen med att använda polyp bail-out som en metod för korallmikropropagation, eftersom det skapar möjligheten att generera många genetiskt identiska individer från en liten bit korall. Användningen av isolerade polyper för forskning har också samma fördelar som cellkulturer när det gäller möjligheten att odlas i kontrollerade laboratoriemiljöer, såsom kolvar och petriskålar. Dessutom har mikrofluidiska plattformar för att upprätthålla levande polyper visat att dessa mikropropagater kan förvaras i relativt billiga och lättrepresenterade miljöer, med kontrollerat vattenflöde, yta och temperatur24,25. Dessa mikrofluidikplattformar kan också användas för att visualisera levande korallstrukturer under ett mikroskop direkt 24,25.
I den här artikeln sammanfattar och demonstrerar vi de tekniker som har utvecklats för att isolera enskilda korallpolyper från sina kolonier, vilket visar hur man behåller dem i laboratorieförhållanden för långsiktig kultur. De metoder som diskuteras inkluderar polypräddning genom hyperosmotiska förhållanden genom avdunstning och pumpning av havsvatten med hög salthalt och inkubation i kalciumfritt havsvatten.
Polypernas överlevnadsgrad efter att ha lämnats in till räddningsprocesser och den tid som krävs för att processen ska slutföras varierar mellan tidigare rapporterade forskning 25,33,41, vilket möjligen förklaras av de olika experimentella metoder som tillämpas i varje studie. Till exempel har olika korallarter, eller till och med koraller från samma art men acklimatiserat sig till olika miljöförhållanden (t.ex. koraller från Röda havet), olika trösklar till salthalterna. Den valda räddningsmetoden och laboratorie-/akvarieförhållandena spelar också viktiga roller för resultaten. I vissa fall har underhållet av korallmikropropagat under laboratorieförhållanden överträffat överlevnadstiden för korallcellskulturer genom att nå månader av överlevnad i azooxanthellat3 3,41 och zooxanthellat25 koraller. Tiden för att polypräddningsprocessen ska vara klar har också varierat i olika studier, allt från några timmar2 5,2 7,30 till veckor35 av inkubation utsatt för stressorn som är ansvarig för att orsaka räddningsaktion. En annan variabel som ska beaktas när man studerar polyp bail-out är återhämtningen av polyperna efter exponering för den akuta stress som utlöste deras frisättning. Det är fortfarande diskutabelt om polyper efter räddningsaktion är i tillräckligt bra skick för att användas som modeller för att studera korallbiologi. Återhämtningen av deras vävnader efter nedbrytningen av coenosarc är en fråga om oro vid användning av dessa mikropropagat. Polyper i många studier, inklusive nutiden, har dock kunnat presentera zooxanthellae-celler inuti sina vävnader och yttre morfologier med intakt oral-aboral polarisering och tentakler veckor efter räddningsaktion 25,27,32,36. Tidigare studier har också funnit att, efter att ha befriats från akut stress, har frigjorda korallpolyper som utsätts för mycket saltlösning eller uppvärmt havsvatten kunnat återställa uttrycket av gener relaterade till processer som apoptos, proteolys och celldelning till nivåer som liknar de som hittades före räddningsaktion32,36 och till och med för att öka uttrycket av gener relaterade till vävnadsläkning36.
När det gäller skillnaden i överlevnad mellan metoder är det viktigt att lyfta fram att den här tiden kan variera mellan olika experiment även om samma tekniker används, och det kan relateras till hälsan hos de använda fragmenten och korrekt underhåll av polyperna efter räddningsprocessen. När det gäller räddningsaktionen genom kalciumfri havsvatteninkubation begränsades polypöverlevnaden till 1 dag. Således kan man dra slutsatsen att metoden inte är väl lämpad för den långsiktiga överlevnaden av de studerade arterna, eller en bättre anpassning av tekniken för P. verrucosa koraller från Röda havet måste göras. De rapporterade resultaten visade att en längre överlevnadstid erhölls med metoderna baserade på den gradvisa ökningen av salthalten, när polyperna utsattes för droppning av vatten med hög salthalt. Denna metod kan ge en mer kontrollerad ökning av salthalten än avdunstningsmetoden, samtidigt som den inte är ansvarig för en ökning av koncentrationen av andra ämnen som finns i havsvattnet, inklusive korallens metaboliska avfall, vilket är potentiellt giftigt för organismen. Av alla dessa skäl har denna metod föreslagits som ett säkrare alternativ för att upprätthålla friska polyper27. Även om denna metod har antagits vara säkrare för polyphälsa och kunna producera polyper som lever längre, ett faktum som bekräftades i denna aktuella publikation, behövs ytterligare undersökningar för att bekräfta det. Båda hög salthaltsinducerade räddningsexperimenten visade en fullständig avlägsnande av polyper efter att salthalten nådde 59 PSU på 24 timmar. Om salthalten ökas förbi den nivå där räddningsaktionen är klar kommer ytterligare stress att orsakas polyperna, vilket minskar deras chans att överleva och återhämta sig från den akuta stressbehandlingen. Därför rekommenderas det inte att behålla polyperna längre i sådana salthalter. Vid utförande av räddningsinduktionsmetoden genom exponering för kalciumfritt havsvatten erhölls en fullständig frigöring från en 3-timmars inkubation i kalciumfritt artificiellt havsvatten, vilket innebär att ytterligare exponering för detta medium inte heller rekommenderas.
För att ta itu med de metoder som var mer adekvata för studier av korallpolyper i laboratorie– / in vitro-undersökningar fokuserade denna studie endast på tre procedurer som tog nära 24 timmar för att räddningsprocessen skulle vara fullständig och användes i studier som involverade långsiktigt underhåll av korallpolyper från scleractinian koraller. Andra metoder som rapporterades ta betydligt längre tid än denna tid var inte engagerade. Uppgörelsen av polyper till ett substrat försöktes inte i denna studie, som fokuserade på att producera polyper som kunde överföras till olika miljöer eller enkelt samlas in för analyser med hjälp av engångspipetter. Resultaten visar att polyper från korallarten P. verrucosa hölls vid liv, med tillhörande zooxanthellae-celler, hälsosam visuell status och en bevarad grov yttre anatomisk struktur, i upp till 8 veckor, även utan bindning till ett substrat. Dessa resultat indikerar att fler biologiska replikat kan genereras från enstaka korallfragment med hjälp av några av de tekniker som demonstrerats i denna studie. Sådana biologiska replikat kan förvaras i kontrollerade miljöer (t.ex. petriskålar och kolvar) och underhållas under laboratorieförhållanden för månadslånga experiment och användas för flera ändamål.
Sedan de första tillfälliga beskrivningarna av polyp bail-out42,43 har nya protokoll upprättats för att hitta mer standardiserade metoder för att inducera polypfrisättning och upprätthålla sådana polyper vid liv, som kan användas för framtida forskningsapplikationer. Dessa inkluderar att undersöka olika aspekter associerade med korall holobiontfysiologin44 och värd-mikrobiominteraktioner45, de molekylära mekanismerna som är involverade i korallblekning 5,25 och hälsa, motståndskraft och skydd av korall holobionten 12,13,46,47 . Dessutom kan frigjorda korallpolyper användas för applikationer utanför forskningsområdet och har föreslagits vara användbara för att skapa propaguler som kan fästa vid ett substrat och växa, vilket potentiellt skapar flera korallindivider som kan användas för restaureringsändamål när standardiserade protokoll för räddningsaktion blir utbredd28 . Sammantaget, även om mer djupgående experiment med räddade polyper bör utföras för att standardisera metoden, har det visat sig att polyp bail-out är ett reproducerbart tillvägagångssätt som kan tillämpas som ett verktyg i korallforskning för flera ändamål.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Adam Barno och Francisca Garcia för deras stöd i experimenten och övervakningen av korallpolyperna. Vi tackar också KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab för deras hjälp när det gäller akvariumunderhåll och infrastruktur. Studien finansierades av KAUST-anslagsnummer BAS/1/1095-01-01.
5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
Percival Incubator – I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |