Dispositivo microfluídico para la separación de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y no tumoral (MCF-10A) mediante dielectroforesis AC

Summary

Las células de cáncer de mama exhiben diferentes propiedades dieléctricas en comparación con las células epiteliales de mama no tumorales. Se ha planteado la hipótesis de que, en base a esta diferencia en las propiedades dieléctricas, las dos poblaciones pueden separarse con fines de inmunoterapia. Para apoyar esto, modelamos un dispositivo microfluídico para clasificar las células MCF-7 y MCF-10A.

Abstract

Los dispositivos dielectroforéticos son capaces de detectar y manipular células cancerosas de una manera sin etiquetas, rentable, robusta y precisa utilizando el principio de la polarización de las células cancerosas en el volumen de la muestra mediante la aplicación de un campo eléctrico externo. Este artículo demuestra cómo se puede utilizar una plataforma microfluídica para la clasificación continua de alto rendimiento de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis hidrodinámica (HDEP) de la mezcla celular. Al generar un campo eléctrico entre dos electrodos colocados uno al lado del otro con un espacio de tamaño micrométrico entre ellos en un chip microfluídico HDEP, las células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) pueden ser expulsadas, exhibiendo DEP negativo dentro del canal principal, mientras que las células de cáncer de mama no metastásico siguen su curso sin verse afectadas cuando se suspenden en el medio celular debido a que tienen una conductividad mayor que la conductividad de la membrana. Para demostrar este concepto, se realizaron simulaciones para diferentes valores de conductividad media y se estudió la clasificación de las células. Se realizó un estudio paramétrico y se encontró una conductividad de mezcla celular adecuada de 0,4 S/m. Al mantener fija la conductividad del medio, se estableció una frecuencia de CA adecuada de 0,8 MHz, lo que proporciona la máxima eficiencia de clasificación, variando la frecuencia del campo eléctrico. Utilizando el método demostrado, después de elegir la conductividad del medio de suspensión de mezcla celular adecuada y la frecuencia de la CA aplicada, se puede lograr la máxima eficiencia de clasificación.

Introduction

Un tumor maligno que se desarrolla dentro y alrededor del tejido mamario es una causa frecuente de cáncer de mama en mujeres de todo el mundo, causando un problema de salud crítico¹. Los tumores de mama antes de la metástasis se pueden tratar mediante cirugía si se detectan en una etapa temprana, pero si se ignoran, pueden tener graves implicaciones en la vida del paciente al propagarse a sus pulmones, cerebro y huesos. Los tratamientos ofrecidos en etapas posteriores, como la radiación y las terapias basadas en productos químicos, tienen efectos secundarios graves². Estudios recientes han reportado que un diagnóstico precoz de cáncer de mama reduce la tasa de mortalidad en un 60%³. Por lo tanto, es imperativo trabajar hacia métodos personalizados de detección temprana. Con este fin, investigadores que trabajan en diferentes campos de la ciencia y la tecnología han utilizado la microfluídica para desarrollar dispositivos para el diagnóstico precoz del cáncer de mama⁴. Estos métodos incluyen microcromatografía de afinidad celular, clasificadores de microcélulas activadas magnéticamente, captura y separación de células cancerosas basadas en el tamaño y dielectroforesis en chip (DEP)^5,6. Estas técnicas microfluídicas relatadas en la literatura permiten la manipulación celular precisa, el monitoreo en tiempo real y la clasificación de muestras bien definidas, que sirven como un paso intermedio en muchas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas⁵. La integración de estos mecanismos de clasificación con microfluídica ofrece una manipulación flexible y fiable de las células diana 7,8,9,10. Una de las principales ventajas de tal integración es la capacidad de trabajar con muestras de fluido en volúmenes de nano a microlitros y también poder manipular las propiedades eléctricas del fluido de muestra. Al ajustar la conductividad del fluido en suspensión dentro de los dispositivos microfluídicos, las células biológicas se pueden clasificar en función de sus tamaños y diferencias en sus propiedades dieléctricas^11,12.

Entre estas técnicas, a menudo se prefiere DEP en chip, ya que es una técnica de clasificación celular sin etiquetas que explota las propiedades eléctricas de las muestras biológicas. Se ha informado que la DEP manipula muestras biológicas como el ADN 13, el ARN 14, las proteínas 15, las bacterias¹⁶, las células sanguíneas 17, las células tumorales circulantes (CTC)18 y las células madre ¹⁹. Los dispositivos microfluídicos que emplean DEP para la clasificación de muestras biológicas han sido ampliamente descritos en la literatura²⁰. Se han descrito dispositivos microfluídicos DEP (rDEP) basados en reservorios para clasificar células de levadura viables y no viables que protegen las células de los efectos adversos de las reacciones electroquímicas^21,22. Piacentini et al. relataron un clasificador de células microfluídicas almenadas que separó los glóbulos rojos de las plaquetas con una eficiencia del 97%²³. También se ha informado que los dispositivos DEP en chip con orificios asimétricos y electrodos integrados clasifican células viables y no viables²⁴. Valero y Demierre et al. modificaron el clasificador de células microfluídicas almenadas introduciendo dos matrices de microelectrodos a ambos lados del canal^25,26. Esto ayudó a enfocar las células en el centro del canal. Zeynep et al. presentaron un dispositivo microfluídico basado en DEP para separar y concentrar células de cáncer de mama MCF7 de leucocitos²⁷. Informaron una eficiencia de extracción de células MCF7 de leucocitos entre 74% -98% con una frecuencia de 1 MHz y un voltaje aplicado que varía de 10-12 V_pp. La Tabla Suplementaria 1 representa una comparación cualitativa y cuantitativa entre los dispositivos de clasificación microfluídica basados en DEP en función de su diseño, configuración de electrodos y parámetros de funcionamiento (frecuencia y voltaje aplicados).

Más recientemente, los investigadores han tratado de medir las diferencias en el comportamiento dieléctrico de las células epiteliales de mama (MCF-10A) y las células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) dentro de un chip microfluídico^28,29. Jithin et al. también caracterizaron las respuestas dieléctricas de diferentes líneas celulares de cáncer utilizando una técnica de sonda coaxial abierta con frecuencias entre 200 MHz y 13.6 GHz³⁰. Estas diferencias en las respuestas dieléctricas de las líneas celulares MCF-7 y MCF-10A pueden explotarse para separarlas en tiempo de ejecución y pueden conducir al desarrollo de dispositivos de diagnóstico personalizados en etapa temprana.

En este artículo, simulamos la clasificación controlada de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis AC. La región de cambio en el campo eléctrico influye en la clasificación dentro del chip microfluídico. La técnica propuesta es fácil de implementar y permite la integración de la técnica de clasificación en varios diseños de chips microfluídicos. Se realizaron simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) para estudiar la separación de células de cáncer de mama no metastásico y células epiteliales de mama no tumorales variando la conductividad del medio fluido en el que se suspendieron las células. En estas simulaciones, se demuestra que, manteniendo la conductividad constante y cambiando la frecuencia aplicada, se puede controlar la separación de las células cancerosas y las células sanas.

Protocol

NOTA: El protocolo aquí utiliza COMSOL, un software de simulación multifísica, para simular la clasificación controlada de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis AC. 1. Diseño del chip y selección de parámetros Abra el software multifísico y seleccione Modelo en blanco. Haga clic con el botón derecho en Definiciones globales y selecc…

Representative Results

Investigar los parámetros operativos óptimos para la clasificación eficaz basada en DEP de células epiteliales de mama no metastásicas (MCF-7) y no tumorales (MCF-10A)Para lograr una separación exitosa de las células epiteliales de mama no metastásicas (MCF-7) y no tumorales (MCF-10A) con propiedades dieléctricas divergentes cuando se someten a dielectroforesis, sus factores K deben ser distintos manteniendo fija la frecuencia aplicada37,38<sup class="xref"…

Discussion

Los dispositivos microfluídicos han sido reportados previamente para cultivo celular, captura y clasificación 47,52,53. La fabricación de estos dispositivos en la sala limpia es un proceso costoso, y es imperativo cuantificar la salida y la eficiencia de un dispositivo microfluídico propuesto a través de simulaciones CFD. Este estudio presenta el diseño y simulaciones de un dispositivo microfluídico AC-dielectroforético …

Materials

COMSOL

COMSOL

multiphysics simulation software