Mückenassoziierte Virusisolierung aus im Feld gesammelten Stechmücken
Summary
Zahlreiche neuartige virusähnliche Sequenzen wurden aufgrund des umfangreichen Einsatzes von Sequenzierungstechnologien in Stechmücken gefunden. Wir stellen ein effektives Verfahren zur Isolierung und Amplifikation von Viren unter Verwendung von Wirbeltier- und Mückenzelllinien zur Verfügung, das als Grundlage für zukünftige Studien zu Stechmücken-assoziierten Viren, einschließlich mückenübertragener und mückenspezifischer Viren, dienen könnte.
Abstract
Mit der breiten Anwendung von Sequenzierungstechnologien wurden viele neue virusähnliche Sequenzen in Arthropoden, einschließlich Mücken, entdeckt. Die beiden Hauptkategorien dieser neuen Mücken-assoziierten Viren sind “durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs)” und “Mückenspezifische Viren (MSVs)”. Diese neuartigen Viren könnten sowohl für Wirbeltiere als auch für Mücken pathogen sein, oder sie könnten einfach eine Symbiose mit Mücken eingehen. Entitätsviren sind unerlässlich, um die biologischen Eigenschaften dieser Viren zu bestätigen. Daher wurde hier ein detailliertes Protokoll zur Virusisolierung und -vermehrung von im Feld gesammelten Stechmücken beschrieben. Zunächst wurden die Mückenproben als Überstände von Mückenhomogenaten präpariert. Nach zweimaliger Zentrifugation wurden die Überstände entweder in die Mückenzelllinie C6/36 oder in die Wirbeltierzelllinie BHK-21 zur Virusamplifikation inokuliert. Nach 7 Tagen wurden die Überstände als P1-Überstände gesammelt und bei -80 °C gelagert. Als nächstes wurden P1-Überstände noch zweimal in C6/36- oder BHK-21-Zellen passageiert, während der Zellstatus täglich überprüft wurde. Als die zytopathogene Wirkung (CPE) auf die Zellen entdeckt wurde, wurden diese Überstände gesammelt und zur Identifizierung von Viren verwendet. Dieses Protokoll dient als Grundlage für zukünftige Forschungen zu Mücken-assoziierten Viren, einschließlich MBVs und MSVs.
Introduction
Stechmücken sind eine Gruppe wichtiger pathogener Arthropoden-Vektoren. Es gibt ungefähr 3.500 Arten von Stechmücken in der Familie Culicidae 1,2. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat zur Entdeckung vieler neuartiger, virusähnlicher Sequenzen in Stechmücken aus verschiedenen Teilen der Welt geführt3. Im Allgemeinen können diese Mücken-assoziierten Viren in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: MBVs und MSVs.
MBVs sind eine Gruppe verschiedener Viren, die Erreger vieler menschlicher oder tierischer Krankheiten sind, wie z. B. das Gelbfiebervirus (YFV), das Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitisvirus (JEV), das West-Nil-Virus (WNV) und das Rift-Valley-Fiebervirus (RVFV)4. Sie haben die öffentliche Gesundheit ernsthaft bedroht, indem sie schwere Morbidität und Mortalität bei Menschen und Tieren auf der ganzen Welt verursacht haben. MBVs halten auf natürliche Weise einen Lebenszyklus zwischen verschiedenen Wirten aufrecht, indem sie von einer infizierten Mücke auf einen naiven Wirt sowie von einem virusinfizierten Wirt und auf eine fressende Mücke übertragenwerden 5. Daher können diese Viren sowohl Mückenzelllinien als auch Wirbeltierzelllinien im Labor infizieren1.
MSVs, zu denen das Yichang-Virus (YCN), das Culex-Flaviviren (CxFV) und das Chaoyang-Virus (CHAOV) gehören, sind eine Untergruppe insektenspezifischer Viren 1,6,7. In den letzten Jahren hat die Entdeckung neuartiger MSVs zugenommen, und es wurde festgestellt, dass einige dieser MSVs einen Einfluss auf die Übertragung von MBVs haben. Zum Beispiel könnte CxFV, eine persistierende Infektion bei Culex pipiens, die WNV-Replikation in einem frühen Stadium unterdrücken8. Ein weiteres insektenspezifisches Flavivirus, das Cell-Fusing Agent Virus (CFAV), hemmt die Ausbreitung des DENV- und Zika-Virus (ZIKV) in Aedes aegypti-Mücken 9. Daher ist dieses Protokoll ein nützlicher Ansatz zur Isolierung von Mücken-assoziierten Viren und kann bei der weiteren Erforschung der Verbreitung von Krankheitserregern, die mit Stechmücken verwandt sind, und der Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieser Methode war es, eine praktikable Möglichkeit zu bieten, Mücken-assoziierte Viren mit Hilfe verschiedener Zelllinien zu isolieren. Es ist wichtig, das Antibiotikum-Antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) zu den Überständen der Mückenhomogenate hinzuzufügen, um eine Kontamination durch Bakterien oder Pilze zu vermeiden. Stechmücken und virale Überstände, die im Feld gewonnen werden, müssen bei -80 °C gekühlt werden, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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