Réactivation de modèles cellulaires démonembranés chez Chlamydomonas reinhardtii

Résumé

La réactivation in vitro des cellules mobiles est une expérience cruciale pour comprendre les mécanismes de la motilité cellulaire. Le protocole décrit la réactivation des modèles cellulaires démembranés de Chlamydomonas reinhardtii, un organisme modèle pour étudier les cils et les flagelles.

Résumé

Depuis l’expérience historique sur la contraction du muscle glycéronique par ajout d’ATP, que Szent-Györgyi a démontrée au milieu du 20ème siècle, la réactivation in vitro des cellules démembranées a été un moyen traditionnel et puissant d’examiner la motilité cellulaire. L’avantage fondamental de cette méthode expérimentale est que la composition de la solution de réactivation peut être facilement modifiée. Par exemple, un environnement à forte concentration de Ca²⁺ qui ne se produit que temporairement en raison de l’excitation de la membrane in vivo peut être reproduit en laboratoire. Les cils eucaryotes (alias flagelles) sont des mécanismes de motilité élaborés dont les mécanismes de régulation doivent encore être clarifiés. L’algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii est un excellent organisme modèle dans le domaine de la recherche des cils. Les expériences de réactivation utilisant des modèles cellulaires démembranés de C. reinhardtii et de leurs dérivés, tels que les axonèmes démembranés de cils isolés, ont contribué de manière significative à la compréhension des mécanismes moléculaires de la motilité ciliaire. Ces expériences ont précisé que l’ATP dynamise la motilité ciliaire et que divers signaux cellulaires, y compris ca²⁺, cAMP et les espèces réactives de l’oxygène, modulent les mouvements ciliaires. La méthode précise de démembranation des cellules de C. reinhardtii et de réactivation des modèles cellulaires est décrite ici.

Introduction

La réactivation in vitro des cellules mobiles démembranées est un outil précieux pour étudier la base moléculaire du mécanisme de régulation de la motilité cellulaire. Szent-Györgyi a d’abord démontré une contraction in vitro de fibres musculaires squelettiques de lapin extraites avec 50% de glycérol en ajoutant de l’adénosine triphosphate (ATP)¹. Cette expérience a été la première à prouver que l’ATP dynamise la contraction musculaire. La méthodologie a rapidement été appliquée à l’étude de la motilité ciliaire/flagellaire énergisée par l’ATP, comme les^{flagelles de sperme 2}, Paramecium cilia

Protocole

Une souche de type sauvage de Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, a été utilisée pour la présente étude. Cc-125 a été obtenu du Centre de ressources Chlamydomonas (voir tableau des matériaux) et maintenu sur un milieu d’agarose Tris-acétate-phosphate (TAP)¹⁶, 1,5% à 20-25 °C.

1. Culture cellulaire

1. Culture de Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) en milieu TAP¹⁶ dans une période clair-sombre de 12 h/12 h (conditions de lumière pour la période de lumière : ~50 photons μmol m⁻² s⁻¹ lumière blanche) à 20-25 °C pendant ....

Résultats

Le processus de démembranation et de réactivation dans la souche de type sauvage C. reinhardtii (CC-125) est montré ici. La culture 2 jours après l’inoculation est devenue une couleur vert clair (étape 1.1) (Figure 1). Les cellules ont été prélevées (étape 2.1), lavées (étape 2.2) et démembranées (étape 2.5). Après la démonembranation, tous les modèles cellulaires sont devenus immotiles (étape 2.7). Les cils démembranés (appelés axonèmes) restent attachés au corps cellulaire, ce qui.......

Discussion

Ce protocole comporte deux étapes critiques. Le premier est un processus connu sous le nom de démembranation, qui doit être effectué doucement mais en profondeur. La déciliation (c’est-à-dire le détachement des cils du corps cellulaire) est induite par un pipetage ou un vortex vigoureux, rendant les modèles cellulaires immobiles même après l’ajout d’ATP. Typiquement, 5 × 10⁷ cellules sont suspendues dans ~0,5 mL de tampon de démembranation (densité cellulaire finale: 1 × 10⁸ cellules / mL). Le taux .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube en plastique de 0,5 mL	QSP	502-PLN-Q
Tube conique de 15 mL	SARSTEDT	62.554.502
Adénosine 5'-triphosphate hydrate de sel disodique (ATP)	Sima-Aldrich	A2383
Centrifugeuse	KUBOTA	2800
Souche de Chlamydomonas CC-125	Centre		de ressources sur Chlamydomonashttps://www.chlamycollection.org/
Créatine kinase	Merck	CK-RO
Créatine phosphate	Merck	CRPHO-RO
Dithiothreitol (DTT)	Nakalai tesque	14128-46
GEDTA(EGTA)	Dojindo	G002
Hepes	Dojindo	GB70
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I8896	Le nom IUPAC est octylphénoxypolyéthoxyéthanol : IGEPAL CA-630 est un substitut du Nonidet P-40 (NP-40) ; NP-40 n’est plus disponible chez Sigma-Aldrich.
MgSO4-7H2O	Nakalai tesque	21002-85
Microscope	Olympus	BX-53
Pipette Pasteur	fisher scientific	13-678-20C
Polyéthylène glycol, Mr 20,000	Merck	8.18897.1000
Acétate de pottasium	Nakalai tesque	28434-25
Hydroxyde de sodium	Nacalai	31511-05
Saccharose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015