Измерение количества копий одноклеточной митохондриальной ДНК и гетероплазмы с помощью цифровой капельно-полимеразной цепной реакции
Summary
Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.
Abstract
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.
Introduction
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме мтДНК, которые могут существовать в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), делеций или дупликации, могут присутствовать на различных уровнях в любой данной клетке, составляя от 0% до 100% от общей популяции мтДНК клетки. Существование геномов мтДНК дикого типа и мутантных в одной и той же клетке называется гетероплазмой, а патогенные гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной митохондриальных заболеваний, с несколькими распространенными неврологическими синдромами, связанными с основными гетероплазматическими мутациями мтДНК4.
Двумя ключевыми параметрами, которые способствуют вероятности гетероплазматической мутации мтДНК, вызывающей клиническое заболевание, являются уровень гетероплазмы и число копий мтДНК. Многие гетероплазматические мутации проявляют пороговый эффект, при этом биохимические и клинические фенотипы становятся очевидными только выше определенного уровня гетероплазмы, обычно около 80%5, и впоследствии ухудшаются по мере увеличения гетероплазмы еще4. Однако также важно учитывать количество копий мтДНК, присутствующих в клетке, поскольку это будет влиять на количество геномов мтДНК дикого типа (то есть «здоровых»), которые присутствуют на данном уровне гетероплазмы. Исследования у пациентов с митохондриальными заболеваниями подчеркнули важность этого взаимодействия между гетероплазмой и номером копии 5,6, а Filograna et al. недавно сообщили об увеличении числа копий мтДНК, облегчающих симптомы, несмотря на неизменную гетероплазму в мышиной модели митохондриального заболевания7.
Хотя в последние годы многое было сделано для улучшения понимания патогенеза и передачи заболеваний, вызванных гетероплазмой мтДНК, большая часть этой работы была проведена на уровне тканей, а не клеток, сравнивая средние уровни гетероплазмы тканей и измерения числа копий, полученные из объемных биопсий тканей и образцов крови. Некоторые хорошо зарекомендовавшие себя методы, такие, как микродиссекция лазерного захвата, позволяют проводить такие измерения на клеточном уровне 8,9; однако недавний взрыв высокопроизводительных одноклеточных методов анализа, или так называемой «одноклеточной омики»10, создал потребность в методах, которые могут точно измерять эти важнейшие параметры мтДНК на уровне одной клетки.
Метод ПЦР капельной генерации использует преимущества последних достижений в области микрофлюидной технологии для улучшения существующих методов количественного определения неизвестных концентраций ДНК с помощью ПЦР-амплификации конкретных целевых ампликонов в образце ДНК11. В отличие от qPCR, где образец ДНК амплифицируется в одной реакции, при этом относительная скорость накопления продукта ПЦР выступает в качестве считывания, этот метод разделяет исходный образец на тысячи отдельных капель, тем самым разделяя молекулы ДНК образца на пространственно разделенные реакции12. Последующая реакция ПЦР протекает в каждой отдельной капле, при этом продукт ПЦР накапливается только в каплях, которые содержат целевую ДНК. Результатом этой реакции является цифровой выход в виде пула капель, которые либо содержат копию целевой ДНК и амплифицированный продукт ПЦР, либо не содержат целевой ДНК. Используя флуоресцентные ДНК-зонды или двухцепочечный (ds)ДНК-связывающий краситель, капли, содержащие амплифицированный продукт, могут быть подсчитаны, а соотношение «положительных» и «отрицательных» капель может быть использовано для расчета абсолютного числа копий ДНК, которые присутствовали в исходном образце. Это абсолютное измерение, в отличие от относительного измерения, полученного в результате реакции qPCR, является ключевым фактором, который позволяет использовать эту методологию для точного измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы в отдельных клетках11, и в нескольких недавних исследованиях уже использовалась технология ПЦР капельной генерации для этой цели13,14 . В этой статье представлен метод измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы делеции в отдельных клетках как из ткани человека, так и из мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).
Materials
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G | |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D’Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A–>G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O’Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
