デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)
Summary
ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、電子伝達鎖の13サブユニットをコードする、小さな環状の二本鎖ミトコンドリア内DNA分子です。二倍体核ゲノムとは異なり、ほとんどの細胞にはmtDNAのコピーが多く含まれており、細胞の種類に応じて100コピー未満から200,000コピーを超える範囲です。MtDNAコピー数は、多くの加齢に伴う変性状態や疾患のバイオマーカーとしてますます使用されているため、mtDNAコピー数の正確な測定は、研究と診断の両方の設定において重要なツールになりつつあります。mtDNAの変異は、一塩基多型(SNP)または欠失として発生することが多く、細胞内のmtDNAのすべてのコピーに存在するか(ホモプラスミーと呼ばれる)、変異したmtDNAコピーとWTmtDNAコピーの混合物として存在する可能性があります(ヘテロプラスミーと呼ばれます)。ヘテロプラズマmtDNA変異は、希少疾患またはパーキンソン病などの一般的な遅発性疾患の増加のいずれかにおいて、臨床ミトコンドリア病理の主な原因です。細胞内に存在するヘテロプラスミーのレベルを決定することは、まれなミトコンドリア病の診断およびミトコンドリアが役割を果たす可能性のある一般的な遅発性疾患を理解することを目的とした研究において重要なステップです。MtDNAコピー数とヘテロプラスミーは、従来、定量的(q)PCRベースのアッセイまたはディープシーケンシングによって測定されてきました。しかし、ddPCR技術の最近の導入は、両方のパラメータを測定するための代替方法を提供しました。絶対mtDNAコピー数を測定する能力や、低いコピー数でも単一細胞から正確な測定を行うのに十分な感度など、既存の方法に比べていくつかの利点があります。ここでは、ddPCRを使用した単一細胞のmtDNAコピー数の測定を説明する詳細なプロトコル(以下、液滴生成PCRと呼びます)と、mtDNA欠失のある細胞のヘテロプラスミーを同時に測定するオプションを紹介します。mtDNA SNPを有する細胞のヘテロプラスミーを測定するためにこの方法を拡張する可能性についても議論されています。
Introduction
哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、ミトコンドリアマトリックスに存在する小さな(約16.5 Kb)環状DNAゲノムであり、2つのrRNA、22のtRNA、および13のタンパク質コード遺伝子で構成される37の遺伝子をコードしています1。細胞ごとに各遺伝子のコピーが1つ(一倍体)または2つ(二倍体)含まれる核ゲノムとは異なり、mtDNAは各細胞のミトコンドリアに複数のコピーとして存在し、数十コピー(成熟精母細胞など)から数十万コピー(卵母細胞など)の範囲で存在します2,3。このマルチコピーの性質の結果、一塩基多型(SNP)、欠失、または重複として存在する可能性のあるmtDNAゲノムの変異が、任意の細胞にさまざまなレベルで存在し、細胞の総mtDNA集団の0%から100%を占める可能性があります。同じ細胞内に野生型および変異型mtDNAゲノムが存在することはヘテロプラスミーと呼ばれ、病原性ヘテロプラズマmtDNA変異はミトコンドリア病の主な原因であり、いくつかの一般的な神経学的症候群が根底にあるヘテロプラスミックmtDNA変異に関連しています4。
ヘテロプラズマmtDNA変異が臨床疾患を引き起こす可能性に寄与する2つの重要なパラメータは、ヘテロプラスミーレベルとmtDNAコピー数です。多くのヘテロプラスミック変異は閾値効果を示し、生化学的および臨床的表現型は特定のヘテロプラスミーレベル(通常は約80%5)を超えてのみ明らかになり、その後、ヘテロプラスミーがさらに増加するにつれて悪化します4。ただし、細胞内に存在するmtDNAのコピー数は、特定のヘテロプラスミーレベルで存在する野生型(つまり「正常」)mtDNAゲノムの数に影響を与えるため、考慮することも重要です。ミトコンドリア病患者を対象とした研究では、ヘテロプラスミーとコピー数5,6の間のこの相互作用の重要性が強調されており、Filogranaらは最近、ミトコンドリア病のマウスモデルで異形質変化にもかかわらず症状を緩和するmtDNAコピー数の増加を報告しました7。
近年、mtDNAヘテロプラスミーによって引き起こされる疾患の病因と伝染の理解を深めるために多くのことが行われていますが、この研究のほとんどは細胞ではなく組織のレベルで行われており、バルク組織生検と血液サンプルから得られた平均組織ヘテロプラスミーレベルとコピー数測定値を比較しています。レーザーキャプチャマイクロダイセクションなどのいくつかの確立された技術は、細胞レベルでのそのような測定を可能にします8,9;しかし、近年のハイスループットシングルセル解析法、いわゆる「シングルセルオミクス」10の爆発的な増加により、これらの重要なmtDNAパラメータをシングルセルレベルで正確に測定できる方法が求められています。
液滴生成PCR法は、マイクロ流体技術の最近の進歩を利用して、サンプルDNA中の特異的標的アンプリコンのPCR増幅を介して未知のDNA濃度を定量する既存の方法を改良する11。サンプルDNAが単一の反応で増幅され、PCR産物の相対蓄積速度が読み出しとして機能するqPCRとは異なり、この方法は最初のサンプルを数千の個々の液滴に分割し、サンプルDNA分子を空間的に分離した反応に区画化します12。その後のPCR反応は個々の液滴で進行し、PCR産物は標的DNAを含む液滴にのみ蓄積します。この反応の結果は、標的DNAおよび増幅PCR産物のコピーを含むか、または標的DNAを含まない液滴のプールの形でデジタル出力される。蛍光DNAプローブまたは二本鎖(ds)DNA結合色素を使用して、増幅産物を含む液滴をカウントし、「陽性」液滴と「陰性」液滴の比率を使用して、初期サンプルに存在したDNAコピーの絶対数を計算できます。qPCR反応から得られる相対的な測定値とは対照的に、この絶対測定は、この方法論を単一細胞のmtDNAコピー数とヘテロプラスミーの正確な測定に使用できる重要な要素であり11、最近のいくつかの研究はすでにこの目的のために液滴生成PCR技術を利用しています13,14.この記事では、ヒトとマウスの両方の組織からの単一細胞におけるmtDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを測定する方法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、上記以外にも幅広い細胞タイプおよび種に適用できますが、以前に検証されたプライマー/プローブの組み合わせから離れる際にメソッドの精度と再現性を維持するには、新しいアッセイデザインの慎重な最適化が重要です。単一細胞を扱う場合、得られた結果が個々の細胞の結果を真に反映していることを確認するために、サンプル収集が可能な限り正確に実…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
液滴生成PCRデータの統計解析に関するアドバイスをくださったL Bozhilova博士に感謝します。図 3C および 図4Bのデータを生成するために使用される卵母細胞を提供してくれたH.Zhang博士に感謝します。この研究は、ケンブリッジ大学の医学研究評議会ミトコンドリア生物学ユニット(MC_UU_00015/9)のSPBによって実施され、PFCが保有するウェルカムトラストプリンシパルリサーチフェローシップ(212219 / Z / 18 / Z)によって資金提供されました。
Materials
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G | |
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