Summary
本协议描述了 体内 人体皮肤脉管系统的多光谱光声图像的采集。这些包括血红蛋白和黑色素的定量，被视为功能分析中感兴趣的发色团。
Abstract
微循环障碍已经在各种疾病过程中得到认可，这是血管研究中这一日益增长的主题的基础。近年来，实时成像系统的发展在基础和临床研究中都设定了（分析）步伐，目的是创建能够提供具有临床兴趣和应用的实时、可量化终点的新仪器。近红外光谱 （NIRS）、正电子发射断层扫描 （PET）、计算机断层扫描 （CT） 和磁共振成像 （MRI） 等技术也可用，但成本、图像分辨率和对比度降低被认为是常见的挑战。光声断层扫描（OT）为血管功能成像提供了新的视角，将最先进的光学吸收和空间分辨率能力（从微米光学到毫米声分辨率）与组织深度相结合。在这项研究中，我们测试了多光谱光声断层扫描（MSOT）对功能成像的适用性。该系统使用由Nd：YAG激光器泵浦的可调谐光学参量振荡器（OPO），提供由3D探头在680 nm至980 nm波长下感测的激发脉冲。从人类前臂获得的图像是根据特定发色团的反应通过特定算法（在制造商的软件中提供）重建的。可以使用该系统测量最大氧合血红蛋白（最大 HbO 2）和脱氧血红蛋白 （最大 Hb）、总血红蛋白 （HbT） 和平均氧饱和度 （mSO2） 与血管密度 （μVu）、单位间平均距离 （ζAd） 和毛细血管血容量 （mm3）。此OT系统发现的适用性潜力是相关的。正在进行的软件开发肯定会提高该成像系统的实用性。
Introduction
心血管疾病是全世界反复出现的首要死亡原因，对任何卫生系统都是沉重负担1，2。技术一直是扩大我们对基本心脏和血管病理生理学的理解的主要贡献者，提供了更精确的诊断工具以及早期疾病检测和更有效管理的可能性。成像技术不仅可以测量心脏和主要血管性能，还可以在更小的范围内计算毛细血管密度、局部灌注和体积以及内皮功能障碍等特征。这些技术首次为血管生物学提供了直接临床应用的定量见解。毛细血管密度、局部灌注减少或闭塞的变化可能对应于缺血性疾病，这有助于解释成像日益增长的作用，成为心血管研究和实践中不可或缺的工具3，4，5。
近年来，功能成像一直引领着技术创新的步伐，超声（美国）、近红外光谱（NIRS）、正电子发射断层扫描（PET）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）是一些众所周知的例子。然而，从成本和患者安全（以及舒适度）到图像对比度和分辨率6，7，多种因素限制了它们的应用。光声断层扫描（OT）最近已成为基于光学的血管研究的新方向。该技术以检测受超短激光脉冲冲击的组织热弹性膨胀产生的超声波为中心，已经知道了一段时间6，8。这种热发育和组织扩张的物理反应唤起了超声换能器检测到的声学信号。使用从可见光到近红外的光脉冲以及没有声学背景信号有利于分辨率深度。检测到的对比是由存在的最重要的发色团（血红蛋白或黑色素）引起的。与其他技术相比，OT具有以下优点：（1）不需要对比度（无标记成像），（2）与超声检查相比，对比度和分辨率更高，伪影更少，（3）价格更低，采集更快且易于操作6，9，10，11。
多光谱光声断层扫描（MSOT）是最新一代的OT仪器之一。使用由提供激发脉冲的Nd：YAG激光器泵浦的可调谐光学参量振荡器（OPO）构建，通过从波长为680 nm至980 nm的高频超声激发脉冲检测到的时间分辨信号获取3D图像，重复频率高达50 Hz12。光声成像平台可深入定量不同的发色团（低至 15 mm）。HbO2、Hb 和黑色素等变量很容易获得。其他感兴趣的变量，如最大氧合血红蛋白（最大HbO2）和脱氧血红蛋白（最大Hb），也可用。制造商软件的重建算法允许计算其他变量，例如血管密度 （μVu）、单位间平均距离 （ζAd） 和毛细血管体积 （mm3）。
本研究探讨了这种新系统的基本操作方面，以更好地了解其在心血管临床前研究中的实用性和潜在应用。
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Protocol
该实验方案先前已获得该大学健康科学学院（EC）伦理委员会的批准。ECTS/P10.21）。程序完全尊重为人类研究定义的良好临床实践原则13.从大学社区中选择了六名健康男女参与者（n = 3 每性别）的方便样本，平均年龄为 32.8 岁± 11.9 岁。选定的受试者被要求血压正常，不吸烟，并且没有任何药物或食物补充剂。血压、心脏频率和体重指数也被记录下来。所有参与者事先都被告知研究的目标和持续时间，并提供知情的书面同意。
注意：本研究是使用MSOTAcuity进行的（见 材料表），此后称为光声成像平台。
1. 收购准备
注意：在下面的实验说明中，屏幕命令采用粗体类型。
- 加载主体信息：打开光声成像设备。在设备预热时，介绍参与者信息。软件的主欢迎窗口将打开扫描 概述。单击 患者ID后，引入数据（包括姓名，研究名称，个人数据和任何相关观察结果），然后按 选择完成申请。
- 预设选择：确保设备屏幕上显示 “激光就绪 ”消息。预热时间过后，设备屏幕上的激光状态栏必须从激光 待机 更改为 激光就绪。对于此协议，预设专为发色团 Hb、HbO2 和黑色素而设计。选择正确的预设后，将测试激光功率。
- 此时，请确保屏幕上有一条消息，提醒房间中的每个参与者应用激光安全谷歌。按下激光（电源）开关脚踏板，等待激光功率自检。几秒钟后，将出现一个窗口，其中包含当前的激光状态和检查报告。按可用的 “确定” 按钮释放此窗口。
注意：光声成像平台使用 Nd：YAG 激光器，被认为是对人眼特别危险的 4 类激光器。因此，必须非常小心地处理这种激光器。
注意：在未确保所有安全程序（包括适当的眼睛保护）到位的情况下，不应进行任何采集。
2. 定位和图像采集
- 使参与者适应实验室环境（21°C±1°C;相对湿度40%-60%），选择舒适的位置以尽量减少不必要的移动。确保先前清洁了要扫描的区域。
注意：建议制造商使用70%乙醇/水溶液清洁要成像的区域。此外，为了获得最佳图像采集，建议脱毛（如果适用）。 - 探头支架和图像稳定
- 在3D杯上涂上一层薄薄的超声凝胶。图像稳定需要将3D罩杯保持在所需的成像位置。定位并稳定感兴趣区域的可锁定臂。本研究中使用的臂是内部设计的，由铝型材组件制成（图1）。
- 将3D杯放在感兴趣区域后，部分锁定稳定臂锁以进行图像采集。
注意：超声凝胶的质量甚至应用至关重要;气泡的存在可能会影响图像清晰度。
- 在 “检查 ”菜单选项卡中使用闭塞后反应性充血（PORH）操作采集动态条件的图像。
- 获取基线控制扫描。找到成像的视野后，将放气的血压袖带固定到位，牢固地锁定 3D 杯定位臂。
- 对成像部位施加最小的压力，因为较高的压力可能会影响读数。推送制造商的默认预设 Hb、HbO2 和黑色素，可同时测量 Hb、HbO2 和黑色素的发色团。
注意：在操作过程中必须使用适当的护目镜保护眼睛。
注意：皮肤光型IV至VI（深色皮肤）容易误读，需要基线对照图像进行进一步处理。在图像采集过程中（激光处于活动状态时）使用安全护目镜只能让人眼识别黄色和蓝色。可以在图像处理过程中编辑颜色。 - 选择基线图像采集的解剖区域。出于探索目的，建议使用腹侧前臂。按下激光脚踏开关踏板继续。
注：标记为 “查看”（ 黄色）的触摸屏按钮，按下时在屏幕上显示实时图像。图像稳定性状态在触摸屏中间显示为灰色条，表示3D探头的稳定性。- 当图像稳定性最大化时，通过按触摸屏上的快照按钮拍摄（或捕获）该区域的 快照 。每次扫描将在2秒的采集时间内，对于预设内定义的每个波长，以150毫米的声学深度采集10-12帧。此基线采集扫描将总共包括 30-36 帧。
注意：每个检测到的发色团（Hb、HbO2 和黑色素）收集 10 帧，最大深度为 15 mm。 - 继续按下激光脚踏开关踏板进行连续视频采集，并注意触摸屏上的 查看 按钮（黄色）。将出现稳定的图像。按录制（蓝色）开始实时图像 录制 。
- 按 停止按钮（ 黑色）停止录制。光声成像平台将停止录制并自动将视频渲染为预览模式。
- 当图像稳定性最大化时，通过按触摸屏上的快照按钮拍摄（或捕获）该区域的 快照 。每次扫描将在2秒的采集时间内，对于预设内定义的每个波长，以150毫米的声学深度采集10-12帧。此基线采集扫描将总共包括 30-36 帧。
- 动态测量（PORH 图示）：将压力袖带调整到患者肘部上方的手臂上，以说明此操作。用收缩压（~200 mmHg）充气袖带，然后按照步骤2.3.1至2.3.3.1进行，在压力下获得成像脉管系统。
- 要获取视频以评估压力释放对成像脉管系统的影响，请在获取视频时打开压力阀，如 2.3.3.2 中所述。和以前一样，跟随屏幕上的实时图像。
注意：要执行此动作，应保持收缩压上1-5分钟;重要的是要意识到，这种压力可能会引起患者不同程度的耐受性和不适。在实验过程中应仔细管理这方面。
3. 图像分析协议
- 将记录的扫描复制到选定/专用文件夹，以便使用制造商的专用分析软件在单独的计算机工作站上进行备份和进一步分析。每次扫描都按采集时间存储，并由程序在带有运行代码的研究文件夹中排序。
注意：强烈建议使用备份副本。可以直接使用记录的原始数据，但强烈建议不要这样做，因为任何潜在的硬盘崩溃都可能损坏原始数据。 - 在工作站计算机上打开分析程序。选择程序 菜单>打开研究 以导入文件并访问备份扫描。打开算例并滚动到文件夹底部（带有记录的扫描），以查找带有 .点头扩展。这是软件识别的唯一文件类型，用于打开算例。
注意：。NOD文件自动命名，每个研究都有一个运行编号，文件名中不携带患者信息。 - 对于图像重建，通过访问软件 菜单>高级处理打开图像分析模块。
- 确保程序工作流选项卡在顶部菜单栏上可见（黑色）（补充图1）： 菜单; 扫描概述; 重建; 通量校正; 光谱解混; 可视化与分析。在分析期间，任何激活的工作流选项卡都显示为蓝色。
注意：如果未打开“ 高级处理 ”，软件将仅显示“ 扫描概述 ”和 “可视化与分析”。
- 确保程序工作流选项卡在顶部菜单栏上可见（黑色）（补充图1）： 菜单; 扫描概述; 重建; 通量校正; 光谱解混; 可视化与分析。在分析期间，任何激活的工作流选项卡都显示为蓝色。
- 通过软件的“重建”选项卡重建图像。从主程序菜单的左侧选择要重建的扫描。加载的扫描显示在屏幕右侧。保留默认的六个光声发射波长（700、730、760、800、850 和 900 nm），因为它们包括 HbO2 在 900 nm 处、Hb 在 760 nm 处和黑色素在 700 nm 处的最大光声信号。
- 使用右侧的图标执行扫描重建。通过选择 扫描 预设和 视野 （分辨率）来遵循程序工作流程。信息显示在主屏幕的左上角。调整声速以调整扫描焦点（补充图2）。 “重建 ”面板还显示每个采集扫描的帧数，并允许选择要分析的重复项（如有必要）。
注意：每次扫描都以 -90 的默认声速加载，应由用户进行调整。声速也可以通过自动对焦功能（AF）自动调整。
- 使用右侧的图标执行扫描重建。通过选择 扫描 预设和 视野 （分辨率）来遵循程序工作流程。信息显示在主屏幕的左上角。调整声速以调整扫描焦点（补充图2）。 “重建 ”面板还显示每个采集扫描的帧数，并允许选择要分析的重复项（如有必要）。
- 按下屏幕顶部的“重建扫描”按钮以前进到 扫描重建 。将显示一个临时仪表板，其中包含消息 “作业处理”。也可以从 “处理状态”菜单>访问此面板。完成重建后，图像后处理分析必须进入 Fluence校正。
- 在仪表板菜单中激活重建图像的 通量校正 。必须加载重建的图像以进行通量校正。它们在每个扫描编号旁边显示一个标志。加载的文件将立即显示在屏幕右侧，作为 选定的重建。通过与屏幕右侧的图标交互来激活 流度校正 （补充图3）。推动 保存流量校正 以继续。
- 保存通量校正后，对采集的预设（Hb、HbO2 和黑色素）进行光谱解混。选择光谱解混选项卡以打开 光谱解混 的 选定重建 列表。将显示所选研究的每次扫描列表，其中包含先前图像处理步骤的历史记录。
- 加载以前保存的通量校正文件。加载的扫描将立即显示在屏幕右侧，作为 选定的重建 （补充图4）。通过按屏幕右侧的图标激活光谱解混。
- 观察要未混合的波长。自动选择进入重建步骤（步骤3.4）的所有六个光声发射波长（700、730、760、800、850和900 nm）进行光谱解混。如有必要，使用 XYZ 图标编辑要处理的所需光谱（例如，光谱：Hb、HbO2 和黑色素）。
- 确认调整后的参数后，单击开始光谱解混以进行 光谱解混 。将出现一个处理菜单栏，显示操作进度。
注意：在光谱解混过程中可以调整各种参数，并且有几种解混方法可用。在该协议中， 线性回归 方法用作解混Hb，HbO2和黑色素的标准品。
- 访问 可视化和分析 选项卡。单击激活的扫描以显示步骤 1.1 中介绍的所有主题信息和注释（补充图 5）。
注意：可以并行显示多个扫描。- 按 + 按钮创建多重扫描分析。在此窗口中，引入多重扫描视图，然后按 “保存 ”按钮。保存视图名称后，将显示一个新的仪表板，包括正在分析的算例的所有扫描。
- 选择要 添加到 保存的分析 视图的每个所需扫描。在左上角图标添加其他扫描，它们将自动显示在 分析视图中。
- 在分析视图中，设置适当的颜色查找表以准备要分析的图像。单击顶部菜单栏上的 更多图像控制选项 ，然后激活 最大强度投影 图标。通过按图像显示右下角与 2D+ 图像显示相邻的可用图标，为图层赋予颜色属性。
- 选择 “更多” 可同时编辑所有通道的颜色。此菜单显示所有未混合的发色团，并允许选择多个层进行显示。
注意：将鼠标移到软件图标上以协议中显示的灰色显示其名称。 - 使用屏幕左下角的工具调整每个图层的颜色强度。
注意：对每个通道进行最小/最大插值调整通常会产生良好的结果。
4. 感兴趣区域 （ROI） 分析
注意：对于数据分析，必须选择感兴趣区域 （ROI）。
- 确定要分析的投资回报率。用 XY 图像中的可用形状（在菜单栏中）包围 ROI，同时在 XZ 和 YZ 轴中可用的正交视图中跟踪相同的 ROI（补充图 6）。
注意：多边形形状用于当前的ROI分析。- 遵循其余 XZ 和 YZ 轴中的 ROI 形状（ 图 2 中的示例），同时使用 添加插值和移除子区域 功能放置多个多边形图层。在定义/选择所需的ROI后，可以绘制数据。
- 按图标导入 要量化的感兴趣区域 ，并观察屏幕右侧显示的多光谱分量，作为所选ROI的图形详细信息。
- 通过按 ROI 数据图形视图底部的 Excel 图标导出 ROI 数据。所有区域的整个数据包将作为捆绑包导出到电子表格中，以供后续分析。 图3 显示了一名参与者的数据，他屈服于充气至200 mmHg的压力袖带，并与0 mmHg的脉管系统静息状态进行了比较。
- 按照步骤4.1-4.1.3同时量化多个ROI对象。
- 从与TIFF文件相同的菜单中导出图像，其中包含所有嵌入数据和内置ROI轮廓（图2）。
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Representative Results
光声成像提供的数据可以在后处理的导出图像（图2）和绘图数据（图3）中进行分析。这里的目的是介绍光声功能成像的操作，并探索其在更常见的血管研究中的应用。为此，我们比较了在休息期间和主要供应动脉闭塞200 mmHg后获得的图像（图2）。这些观察结果可以在ROI分析和导出后量化。在XY平面中，可以观察到与平面YZ和XZ相比，黑色素的信号更高，这表明表皮极限。肱动脉（臂）闭塞会在 OT 探头放置（腹侧前臂）之前引起血管的一些淤滞。因此，我们检测到整体信号的增加，表现为XY，YZ和XZ轴处的蓝色（Hb）和红色（HbO2）增加。在 XY 平面上，当袖带内保持 200 mmHg 的压力时，可能会出现淤滞。与正常灌注条件（无闭塞）相比，YZ 和 XZ 轴描绘了由于上述闭塞而导致的血容量增加，洋红色掩蔽区域突出显示。
相同微血管区域的导出ROI分析从8.6秒内收集的稳定图像中量化发色团HbO 2（红色），Hb（蓝色）和HbT（粉红色），mSO2（深红色）和黑色素（黄色）。立即检测到压力释放;图3显示了Hb、HbO2和HbT恢复的闭塞后演变，而光声数据输出遵循图1中的观测结果。该软件通过添加 Hb 和HbO 2 任意信号来计算血氧饱和度 （mSO2） 和 HbT 值。黑色素浓度在200 mmHg遮挡内保持恒定，并在图像采集的时间间隔内处于静止状态。
图 1：表示柔性臂的示意图，该臂设计用于将测量探头与参与者的皮肤稳定接触。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：代表性光声图像突出显示了静止或压力为 200 mmHg 时脉管系统的变化。 显示的图像包括三种颜色，分别代表Hb（蓝色），HbO2 （红色）和黑色素（黄色），如第4节的图像分析中所述。每个光声图像代表与每个扫描发色团相关的所有平面的最大强度投影。（A）光声采集的XY平面。（B）同一光声成像位点的YZ正交视图。（C） 扫描区域的 XZ 视图。洋红色箭头指向停滞增加的区域;洋红色遮盖区域标志着与正常灌注条件（无闭塞）相比，由于肱动脉闭塞而导致的血管内血液量增加。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：量化 ROI 的代表性数据导出。从从8.6秒收集的稳定图像中提取的数据中描绘了HbO 2（红色），Hb（蓝色）和HbT（粉红色），mSO2（深红色）和黑色素（黄色）的天然发色团。来自 Hb、HbO2 和 HbT 的图表显示了从闭塞到非闭塞静息状态的恢复斜率。计算的血液氧合mSO2和黑色素浓度在200 mmHg闭塞内保持恒定，并在图像采集的时间间隔内保持静止状态。提取的图像是描述为平均± sd的数据点，每帧n = 10张图像。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：扫描概览面板和分析软件的主菜单。按下“菜单”按钮（黑色），主 菜单 将下拉选项以选择所选研究。此操作将选择并加载软件识别的“.nod”文件。扫描 概览 （蓝色）显示所有研究的扫描。详细信息（黑色）显示在右侧。 请点击此处下载此文件。
补充图2：重建分析工作流程。面板1 - 选择要重建的扫描，然后按显示屏右侧的向右箭头（紫色箭头）前进。面板2 - 观察声速并将滑块调整到最佳焦点（蓝色箭头）;a） 调整后的焦点显示在窗口右侧;b） 选择要分析的重复项（黄色箭头）;c） 按 重建扫描 按钮继续（绿色箭头）。 请点击此处下载此文件。
补充图3：流度校正面板工作流程。面板1 - 选择要更正的扫描，然后按屏幕右侧的向右箭头。面板 2 - 按 保存流量校正以继续（绿色箭头）。 请点击此处下载此文件。
补充图4：光谱解混面板工作流程。面板1 - 选择要取消混合的扫描，然后按向右箭头（紫色箭头）。图2 a）选择要解混的扫描（蓝色箭头），调整后的图像的预览将显示在右侧;b） 选择要取消混合的重复项（黄色箭头）;c） 按 开始光谱解混 继续（绿色箭头）。 请点击此处下载此文件。
补充图5：可视化面板和发色团颜色的选择。面板 1） 双击选择要显示的扫描件（紫色箭头）;图2）在XY（蓝色方块），XZ（黄色方块）和YZ（绿色方块）轴上采集的图像;2a） 显示采集波长的图像分析按钮;2b） 在顶部菜单栏中选择 更多图像控制选项 并激活 最大强度投影 图标;选择 “更多” 以编辑频道的颜色。 请点击此处下载此文件。
补充图6：感兴趣区域（ROI）的选择。选择套索工具（黄色箭头）并在 XY 轴（洋红色箭头）内定义 ROI 的边界。可以定义各种形状区域（多边形、矩形、正方形、圆形或椭圆形）。遵循 XZ 和 YZ 轴中的 ROI，并将子区域（绿色箭头）添加到初始选择中。将显示多个子区域（青色箭头）。要从选定的ROI中提取数据，请按图标导入 要量化的感兴趣区域 并继续。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议强调了操作这种新型光声成像仪器的实际要求的工作步骤，从3D杯探针稳定所需的适当定位（参与者，探头）到图像采集，ROI选择以及图像重建和分析。
所提出的实验方法使用“瞬时”采集以及在动态条件下获得的图像，说明了该仪器在访问 体内 人体血管生理学方面的兴趣和实用性。如图所示，以高达15 mm3 的体积收集的150 μm声学图像分辨率是其他断层扫描技术无法比拟的。
需要特别注意（i）探头稳定对图像采集的重要性;使用灵活、安全的探头支架明显改善了图像采集;（二）正确识别血管结构;超声参考（例如表皮-真皮过渡中的黑色素）可用作识别皮肤上丛血管的标志物;（iii）通过制造商的重建软件进行的功能图像分析。
ROI数据和图像导出的高级分析需要更深入地理解专用软件和开发的算法。目前的光声成像仪器能够以150μm的分辨率重建15mm3 组织的3D体积。应增强这种能力，以更好地深度量化微血管功能。然而，基本操作允许直接观察参考发色团并从同一区域获取多个预设，提供快速扫描和实时视频录制。
光声成像系统的适用潜力是相关的。正在进行的软件开发肯定会提高该成像系统的实用性。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由ALIES和COFAC正在研究的技术的主要提供者以及通过向CBIOS提供的UIDB / 04567 / 2020资助的科学和技术基金会（FCT）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cuff | PIC | 107001 | |
| Drapes | Pajunk | 021151-1501 | |
| Ethanol 70% | Sigma Aldrich | EX0281 | |
| Gogless | Univet | 559G.00.00.201 | |
| Kimwipes | Amoos | 5601856202331.00 | |
| MSOT | iThera | MSOTAcuity | |
| Stabilizing arm | ITEM | Self designed and assemble | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 308 | |
| Waxing cream | Veet | kkdg08hagd |
References
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