Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

Résumé

Les études de la biomécanique de la paroi cellulaire sont essentielles pour comprendre la croissance et la morphogenèse des plantes. Le protocole suivant est proposé pour étudier les parois cellulaires primaires minces dans les tissus internes des jeunes organes végétaux à l’aide de la microscopie à force atomique.

Résumé

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales et, par conséquent, la taille et la forme futures de la plante. De nombreuses techniques sophistiquées ont été développées pour mesurer ces propriétés; Cependant, la microscopie à force atomique (AFM) reste la plus pratique pour étudier l’élasticité de la paroi cellulaire au niveau cellulaire. L’une des limites les plus importantes de cette technique a été que seules les cellules vivantes superficielles ou isolées peuvent être étudiées. Ici, l’utilisation de la microscopie à force atomique pour étudier les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires appartenant aux tissus internes d’un corps végétal est présentée. Ce protocole décrit les mesures du module apparent de Young des parois cellulaires dans les racines, mais la méthode peut également être appliquée à d’autres organes végétaux. Les mesures sont effectuées sur des coupes de matériel végétal dérivées de vibratomes dans une cellule liquide, ce qui permet (i) d’éviter l’utilisation de solutions plasmolysantes ou d’imprégnation d’échantillons avec de la cire ou de la résine, (ii) de rendre les expériences rapides et (iii) de prévenir la déshydratation de l’échantillon. Les parois cellulaires anticlinales et périclinales peuvent être étudiées, selon la façon dont le spécimen a été sectionné. Les différences dans les propriétés mécaniques des différents tissus peuvent être étudiées dans une seule section. Le protocole décrit les principes de planification de l’étude, les problèmes liés à la préparation et aux mesures des éprouvettes, ainsi que la méthode de sélection des courbes force-déformation pour éviter l’influence de la topographie sur les valeurs obtenues du module d’élasticité. La méthode n’est pas limitée par la taille de l’échantillon, mais est sensible à la taille des cellules (c.-à-d. que les cellules avec une grande lumière sont difficiles à examiner).

Introduction

Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire végétale déterminent la forme de la cellule et sa capacité à se développer. Par exemple, l’extrémité en croissance du tube pollinique est plus molle que les parties non en croissance du même tube¹. La formation de primordia sur le méristème d’Arabidopsis est précédée d’une diminution locale de la rigidité de la paroi cellulaire sur le site du futur primordium ^2,3. Les parois cellulaires d’Arabidopsis hypocotyle, qui sont parallèles à l’axe de croissance principal et se développent plus rapidement, sont plus molles que ce....

Protocole

1. Préparation des échantillons pour les mesures AFM

1. Matériel végétal: Stériliser les graines de maïs (Zea mays L.) et de seigle (Secale cereale L.) avec une solution de NaOCl à 0,35% pendant 10 min, laver 3x avec de l’eau distillée, puis cultiver en hydroponie dans l’obscurité à 27 °C pendant 4 jours et 2 jours, respectivement. Des racines primaires ont été utilisées pour l’expérience.
2. Préparation des solutions et de l’échantillon pour la section des vibratomes
   1. Préparer la solution d’agarose pour l’encastrement des racines en dissolvant 3 % (p/p) d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau à l’aide d’un ....

Résultats

Les cartes typiques du module d’élasticité et du LDF, ainsi que les courbes de force obtenues sur les racines de seigle et de maïs par la méthode décrite, sont présentées à la figure 2. La figure 2A montre les cartes du module d’élasticité et du LDF obtenues sur la section transversale de la racine primaire du seigle. Les zones blanches dans la carte des modules (Figure 2A, à gauche) correspondent à une surestimation erronée du modu.......

Discussion

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales, et donc la taille et la forme futures de la plante. La méthode basée sur l’AFM présentée ici complète les techniques existantes qui sont utilisées pour étudier les propriétés des parois cellulaires végétales. Il permet d’étudier l’élasticité des parois cellulaires, qui appartiennent aux tissus internes de la plante. En utilisant la méthode présentée, les propriétés mécaniques des parois cel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose, point de fusion bas	Helicon	B-5000-0.1	pour la fixation de l’échantillon
Brosse	-	-	pour section
mobile Cantilevers	NanoTools, Allemagne	NT_B150_v0020-5	Modèle : Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russie	FMG01/50	Modèle : FMG01
Adhésif cyanoacrylate	-	-	pour
Lames en verre	Heinz Herenz	1042000	pour la vibratomie et l’étalonnage AFM
Logiciel ImageAnalysis P9	NT-MDT, Russie	-	pour l’analyse des données
Microscope à épifluorescence Leica DM1000	Leica Biosystems, Allemagne	11591301	pour le contrôle de section
NaOCl	-		pour la stérilisation des semences
Nova PX 3.4.1 Logiciel	NT-MDT,	Russie-pour	les expériences menées Microscope
NTEGRA Prima avec contrôleur HD	NT-MDT, Russie-pour		l’AFM et l’acquisition de données
Boîte de Pétri 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	pour la fixation d’échantillons
Pipette à pointe 1000 µ ; L	Thermo Fisher Scientific	Pipette à	4642092-Tip
2-20 & micro ; L	Thermo Fisher Scientific		4642062-Eau
ultrapure	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Allemagne	1404723512	pour la coupe d’échantillons