אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

Summary

מחקרים על ביומכניקה של דופן התא חיוניים להבנת גדילת צמחים ומורפוגנזה. הפרוטוקול הבא מוצע לחקור דפנות תאים ראשוניות דקות ברקמות הפנימיות של איברים צמחיים צעירים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי.

Abstract

התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. טכניקות מתוחכמות רבות פותחו למדידת תכונות אלה; עם זאת, מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) נותרה הנוחה ביותר לחקר גמישות דופן התא ברמה התאית. אחת המגבלות החשובות ביותר של טכניקה זו הייתה שניתן לחקור רק תאים חיים שטחיים או מבודדים. כאן מוצג השימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי כדי לחקור את התכונות המכניות של דפנות התאים הראשוניות השייכות לרקמות הפנימיות של גוף הצמח. פרוטוקול זה מתאר מדידות של מודולוס דפנות התאים של יאנג לכאורה בשורשים, אך ניתן ליישם את השיטה גם על איברים צמחיים אחרים. המדידות מבוצעות על מקטעים שמקורם ברטט של חומר צמחי בתא נוזלי, מה שמאפשר (1) להימנע משימוש בתמיסות פלסמוליזה או הספגת דגימה בשעווה או בשרף, (2) להפוך את הניסויים למהירים, ו-(3) למנוע התייבשות של הדגימה. ניתן לחקור הן את דפנות התאים האנטי-קלינליים והן את דפנות התאים הפריקלינליים, בהתאם לאופן שבו נותחה הדגימה. הבדלים בתכונות המכניות של רקמות שונות ניתן לחקור בסעיף אחד. הפרוטוקול מתאר את עקרונות תכנון המחקר, בעיות בהכנת דגימות ומדידות, וכן את השיטה לבחירת עקומות דפורמציה של כוח כדי למנוע את השפעת הטופוגרפיה על הערכים המתקבלים של מודולוס אלסטי. השיטה אינה מוגבלת על ידי גודל המדגם אלא רגישה לגודל התא (כלומר, תאים עם לומן גדול קשים לבדיקה).

Introduction

התכונות המכניות של דופן התא הצמחי קובעות את צורת התא ואת יכולתו לגדול. לדוגמה, הקצה הגדל של צינור האבקה רך יותר מהחלקים שאינם גדלים של אותו צינור¹. להיווצרות הפרימורדיה ב-Arabidopsis meristem קדמה ירידה מקומית בנוקשות דופן התא באתר של הפרימורדיום ^2,3 העתידי. דפנות התאים של ערבידופסיס היפוקוטיל, המקבילות לציר הצמיחה העיקרי וצומחות מהר יותר, רכות יותר מאלו הניצבות לציר זה וצומחות לאט יותר ^4,5. בשורש התירס, מעבר התאים מחלוקה להתארכות לווה בירידה במודולי האלסטי בכל רקמות השורש. המודולי נשאר נמוך באזור ההתארכות ועלה....

Protocol

1. הכנת דגימות למדידות AFM

1. חומר צמחי: לעקר את זרעי התירס (Zea mays L.) והשיפון (Secale cereale L.) עם תמיסת NaOCl של 0.35% למשך 10 דקות, לשטוף פי 3 במים מזוקקים, ולאחר מכן לגדול באופן הידרופוני בחושך בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים ויומיים, בהתאמה. שורשים ראשוניים שימשו לניסוי.
2. הכנת תמיסות ודוגמאות לחיתוך ויברטום
   1. הכינו תמיסת אגרוז להטמעת שורשים על ידי המסת 3% (w/w) נקודת התכה נמוכה של אגרוז במים באמצעות תנור מיקרוגל.
      הערה: כל הניסויים בוצעו במים. אם נדרש חיץ או כל סוג אחר של מדיום למחקר, עדיף להשתמש באותו מדיום להכנת אגרוז, במהלך החתך, ובתא הנוזלי של ה- AFM כדי למנוע פגיעה בדגימה.
   2. יוצ....

Results

מפות אופייניות של מודולוס אלסטי ו-DFL, כמו גם עקומות כוח המתקבלות על שורשי שיפון ותירס בשיטה המתוארת, מוצגות באיור 2. איור 2A מראה מפות מודולוס אלסטיות ומפות DFL המתקבלות על החלק הרוחבי של השורש הראשוני של שיפון. האזורים הלבנים במפת המודולוס (איור 2A, משמאל) תואמים להערכת יתר שגויה של המודולוס של יאנג בגלל שהסורק מגיע לגבול שלו בכיוון z. תמונה זו אינה נוחה לשימוש כמפה חיצונית לבחירה נוספת של עקומות כוח משביעות רצון. מפת האותות DFL (.......

Discussion

התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. השיטה מבוססת ה-AFM המוצגת כאן משלימה את הטכניקות הקיימות המשמשות לחקר התכונות של דפנות תאי צמחים. הוא מאפשר לחקור את גמישות דפנות התא, השייכות לרקמות הפנימיות של הצמח. בשיטה המוצגת מופו התכונות המכניות של דפנות התאים ברקמות שונות של שורש התירס הגדל, ונבנה מודל מתמטי המבוסס על תכונות אלה⁶. השורש המדומה הגיב להפעלת לחץ המחקה טורגור על ידי שינויים בגודל ליניארי. שינויים אלה היו באות.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אגרוז, נקודת התכה נמוכה	הליקון	B-5000-0.1	לקיבוע מדגם
מברשת	-		להעברת חתך
Cantilevers	NanoTools, גרמניה	NT_B150_v0020-5	דגם: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, רוסיה	FMG01/50	דגם: FMG01
דבק ציאנואקרילט	-		עבור שקופיות זכוכית ויברטומיה
	היינץ הרנץ	1042000	לוויברטומיה וכיול AFM
תוכנת ImageAnalysis P9	NT-MDT, רוסיה		- לניתוח נתונים
Leica DM1000 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי	Leica Biosystems, גרמניה	11591301	לבדיקת סעיף
NaOCl	-		לעיקור זרעים
תוכנת Nova PX 3.4.1	NT-MDT, רוסיה		- לניסויים בביצוע
מיקרוסקופ NTEGRA Prima עם בקר HD	NT-MDT, רוסיה		- ל- AFM ורכישת נתונים
צלחת פטרי 35 מ"מ	Thermo Fisher Scientific	153066	לקיבוע דגימה
פיפטה קצה 1000 ומיקרו; L	Thermo Fisher Scientific		4642092-Tip
פיפטה 2-20 ומיקרו; L	תרמו פישר סיינטיפיק		4642062-מים
אולטרה-טהורים	-	--
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, גרמניה	1404723512	לחיתוך דגימה